新型冠状病毒的单细胞多组学研究scRNA-seq+scATAC-seq

自2019年新冠病毒肆略以来，众多科学家们从各种不同的技术及科研角度来研究新冠病毒，虽然新冠疫苗已经成熟并且大多数人也已经接种，但是新冠病毒不断的变异，它对人类的影响还在持续，附在人类头顶的阴影也仍然不能去除。

单细胞技术的发展在新冠病毒的研究中起到了十分重要的作用。Z初新冠病毒大爆发时，是单细胞转录组的实验研究给了科研工作者知道，让我们了解到ACE2这个蛋白在新冠病毒感染中的起重要作用。

目前，高通量单细胞实验不同组学方案不断优化及革新。通过单细胞多组学来研究新冠病毒的调控机制，为我们对抗新冠病毒能给予更新的思路。

本文分享了文献Single-cell multiomic profiling of human lungs reveals cell-type-specific and agedynamic control of SARS-CoV2 host genes，本文对感染新冠病毒的样本进行scRNA-seq+scATAC-seq的单细胞多组学研究，让我们来看看新冠病毒在新技术中的应用情况吧。

新冠病毒感染的宿主蛋白已经报道了较多，Z经典的要属ACE2啦，除此之前，还有TMPRSS2和CTSL这两个裂解病毒刺突蛋白从而促使病毒进入宿主。而BSG是另一个可以结合病毒刺突蛋白的受体，同时FURIN编码蛋白酶靶向新冠病毒。本文也重点关注这五个蛋白的基因来看看他们在人类肺部中的表观调控表现。

1、单细胞分群结果

选取3个不同年龄段的组织样品进行单细胞实验：30周胎龄（30WK^GA）、3周岁（3yo）和30周岁（30yo）。snRNA-seq共捕获到46500个细胞核，snATAC-seq共捕获了90980个细胞核。对两组单细胞数据分别进行分群，发现两组表观多组学数据都分到了19个细胞群，分别是epithelial cell(AT1-alveolar type 1, AT2-alveolar type 2, club, ciliated, basal和pulmonary neuroendocrine), mesenchymal cell(myofibroblast, pericyte, matrix fibroblast 1和matrix fibroblast 2), endothelial cell(arterial, lymphatic, capillary 1 and capillary 2)以及hematopoietic cell types (macrophage, B-cell, T-cell, NK cell和enucleated erythrocyte)，具体情况见下图：

图：人肺部组织snRNA-seq以及snATAC-seq的分群结果及细胞注释marker基因情况

2、 与SARS-CoV-2进入宿主细胞时关键基因的特异性细胞表达及调控

作者重点关注ACE2、TMPRSS2、CTSL、BSG和FURIN在两组单细胞表观多组学数据中的表达情况以及远端调控模式。结果显示大部分TMRRSS2表达的细胞在上皮细胞（包含AT1、AT2以及棒状、纤毛状和杯状细胞的气道细胞），CTSL、BSG和FURIN在AT1、AT2、基质成纤维细胞1,2和M1巨噬细胞。对于染色质开放性研究，ACE2和TMPRSS2在AT1、AT2和气道细胞如棒状，纤毛，和基底细胞。相反，CTSL基因体显示染色质可跨上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞，BSG和FURIN也显示出广泛的染色质可及模式，在内皮细胞(如毛细血管)中活性Z高。这表明气道和肺泡上皮细胞都表达对SARS-CoV-2进入至关重要的基因。细胞类型特异性表达谱主要由远端CREs(如增强子)建立。作者在肺部组织中鉴定出了398385个cCREs，其中，与ACE2启动子区关联的co-accessible位点有15个，与TMPRSS2启动子关联的位点有73个，与CTSL关联的有73个，与FURIN关联的有213个，与BSG关联的有64个。详情见下图：

3、AT2细胞中与TMPRSS2相关的远端调控元件CREs与年龄调控相关

AT2细胞是一种丰富的上皮细胞类型，位于COVID-19扰乱呼吸的肺泡区。因此，我们专注于AT2细胞来评估不同供体年龄组的病毒进入基因动态。作者观察到成人肺中表达ACE2和TMPRSS2的AT2细胞比例高于儿童样本，显著性分析发现ACE2与TMPRSS2的表达情况在不同的年龄段有显著差异，而BSG、CTSL和FURIN则没有显著差异。

对AT2细胞中的cCREs与年龄相关的特性分析。因为ACE2相关细胞数量较少，且TMPRSS2对冠状病毒进入宿主细胞至关重要，作者主要关注TMPRSS2细胞。作者在scATAC-seq结果的AT2细胞中鉴定到了22745个与年龄相关的位点，这些位点可以分成5个部分cI~cV。与TMPRSS2相关的位点主要集中在30yo组的CIII和3yo及30yo组的cIV。这些位点主要集中在病毒感染、免疫应答和损伤修复(如病毒从宿主细胞释放)、干扰素- γ介导的信号通路和ERBB信号通路的正调控等过程。对获得的motif分析发现这些motif对应的转录因子控制细胞的命运。另外，控制AT2细胞的免疫调控中，也有一些转录因子涉及（STAT、IRF和FOS/JUN）。

采用无监督的方式分析发现9个TMPRSS2 co-accessible相关的年龄相关位点，从之前AT2中分析的73个co-accessible位点分析与年龄的相关想，发现有其他10个位点与年龄相关。在总共的19个TMPRSS2 co-accessible-年龄相关位点中，17个具有统计学意义。而TMPRSS2启动子区域的开放性状态在3个不同的年龄段没有差异，说明TMPRSS2的差异是由远端调控模式引起的。

4、与呼吸表型和TMPRSS2表达有关的TMPRSS2连锁cCREs遗传变异预测

通过定位与TMPRSS2连接的远端cCREs，作者接下来可以识别非编码序列变异，这些变异可能影响顺式调节活性，并有助于TMPRSS2表达的个体间差异和肺病风险。因此，作者描述了19个cCREs的遗传变异，这些cCREs的染色质可及性随年龄增长而增加，并与AT2s中的TMPRSS2相关联。

基因组突变频率数据库gnomAD v3 database下载的2270例单体序列变异数据与AT2中TMPRSS2 age-increasing cCREs关联分析。将前面鉴定到的转录因子如CEBP、ETS、NKK、FOXA、IRF和STAT与变异数据进行关联分析，Z后鉴定到1100个变异体，其中50个是常见变异，而10个与AT2中的开放性相关。

之后用UK Biobank（UKBB）与AT2开放性相关的10个变异体进行GWAS分析，以期检验这些突变体是否与呼吸功能、感染、用药或其他性状相关的表型相关。结果表明rs35074065突变体与肺气肿Z相关，这一突变体也有证据说与哮喘相关。剩下的9个变异中大多数在名义上至少有一种与呼吸功能或呼吸药物使用相关的表型，包括支气管扩张，细菌性肺炎、COPD、哮喘和用于治疗哮喘的药物如serevent。

将GTEx v8 release中的eQTL数据与10个突变体进行关联分析，结果发现与TMPRSS2表达的eQTL相关的突变体有rs35074065、rs1557372和rs9974995。其中rs35074065与TMPRSS2表达有非常直接的关联。ScRNA-seq数据探寻rs35074065相关的细胞类型发现，AT2细胞和巨噬细胞Z关联。

5、精细定位COVID-19呼吸衰竭的风险变异3p21.31位点在肺单细胞数据中特异性染色质位点分析

在SARS-CoV-2的研究中，感染呼吸衰竭风险的位点3p21.31位于非编码区域。作者将这一位点进行关联分析。位点3p21.31有22个候选突变，其中一个位点rs17713054与AT2中的cCRE相关联，而rs76374459与红细胞cCRE关联。rs17713054位点预测可以结合转录因子CEBPA和CEBPB的motif，同时分析ENCODE计划中CEBPB的ChIP-seq数据发现该位点与CEBPB的peak区域有重叠。而rs76374459与SP11的ChIP-seq数据有重叠。3p21.31信号的候选因果变异也显示了与呼吸表型的名义关联的证据，例如支气管扩张药物、肺气肿和慢性支气管炎等。rs17713054通过scATAC数据关联scRNA数据探寻到关联基因SLC6A20, LIMD1, SACM1L和CCRL2，其中SLC6A20主要存在于AT2细胞。eQTL关联分析发现rs17713054与SLC6A20基因表达关联度小，但是观察到与SLC6A20的名义关联，其中次要等位基因A的表达增加。进一步用eQTL模型分析单细胞数据中rs17713054与SLC6A20基因表达相关性，发现rs17713054与SLC6A20在AT2或者AT1/AT2细胞类型中有强相关性，表明rs17713054可能调控SLC6A20基因表达。