手把手教您怎么研究转录因子

       首先，转录因子是什么？直接上概念，转录因子(Transcription Factors, TFs)指能够以序列特异性方式结合DNA并且调节转录的蛋白质。对于这个概念需要重点关注的是1、转录因子主要功能是来调节基因的转录水平； 2、这种调节是通过结合DNA来实现的；3、结合的DNA具有序列特异性。因此对于研究一个转录因子，需要重点阐述的清楚这两个事情，一个是结合的DNA是什么，特异性的结合序列是哪些 二是可能调控的基因是什么？那么对于转录因子，阐述清楚这两个就可以了吗？那也太小看转录因子了，那我们坐下来慢慢说。

（https://www.alamy.com/stock-photo/transcription-factor.html）

还是回到第一个问题，转录因子是什么？其实对于大多数基因而言，更为重要的是这个基因是转录因子吗？这个问题其实不难，现在通过基因的同源注释即可以推测这个基因是不是一个转录因子，背后原因在于转录因子都具有保守的结构域，这个结构域包括结合域和调控域，那么重要的是其中的结合域，一方面，结合域直接决定了他的结合DNA的情况，另外结合域的保守性决定了这个转录因子到底是哪个家族的？因此，针对某些物种基因组注释没有那么透彻同时又关注某个转录因子家族的老师，对研究物种中某个基因组家族基因进行全局鉴定也是研究的方向，也是一个短平快的文章很好的选择（怎么做呢？与常规修饰酶鉴定等方法一致，还不清楚的话，参考一下XXXX）

（https://zh.wikipedia.org/）

第一个问题解决了，那第二个问题来了，转录因子功能是什么？我们都知道他调控了基因的表达，那调控基因是为了什么呢？这个问题其实就是一个基因功能的验证的问题，主要可以从几个方面考虑，首先，表达量，转录因子表达有时空特异性，例如NKX1-2转录因子，在脂肪细胞分化过程中高度表达，推测与研究证明，其与脂质生成相关。干扰素调节因子4（IRF4）是IRF家族的成员，主要在淋巴细胞中表达，并在淋巴瘤的发生发展中发挥着重要作用。因此对于其在不同组织类型或者不同生命活动中具有明显较高的表达丰度，则推测其与该生命活动中具有较高相关性。另外就是经典的基因功能验证实验了，通过过表达或者敲除、沉默转录因子，通过表型鉴定等，推测其功能。

功能已经知道了，那下面就要解析机制了。那这时候就是要回归到转录因子本身功能特性:第一，与特异性DNA序列结合调节转录，第二，与其他蛋白互作完成功能。因此我们需要解决的主要就是这两个机制。首先我们先关注互作的蛋白是谁，这个就需要通过CoIP等实验进行互作的蛋白鉴定，其互作蛋白的特性也赋予了转录因子功能上的多样性，具体功能就需要针对互作蛋白具体蛋白具体分析了。另外就是这个转录因子结合的DNA序列到底是什么。这个时候就需要利用经典的蛋白和DNA互作的研究手段来进行鉴定了，现在主流的技术手段包括ChIP-seq和CUT-Tag。其中ChIP-seq即染色质免疫共沉淀测序，实验上是通过染色质提取后，利用特异性的抗体捕获特异性的蛋白（即我们关注的转录因子）同时将转录因子上结合的DNA进行捕获，随后将DNA进行建库测序分析，就可以知道结合的DNA到底是什么了。CUT-Tag也是当前利用手段较多的研究蛋白和DNA互作的方法，其原理是抗体进入透过细胞核后与特异性识别和结合目的蛋白，随后引导Tn5转座酶在抗体结合区域进行切割和扩增，随后通过测序就可以知道结合的DNA序列是什么。ChIP-seq体系稳定成熟，适用于大多数情况，CutTag其背景信号更干净，且起始量低，适用于珍惜样本。

（https://www.activemotif.com/catalog/819/chip-sequencing-service）

测序数据下机是一堆的reads，那怎么分析才能知道结合的序列是什么呢？ChIP和CutTag分析流程大体一致，基本原理是找到reads显著性堆叠的区域，即peak区域，则该peak区域即为分析上蛋白结合的DNA区域。怎么来理解这个逻辑，原因在于在实际实验过程中，只有转录因子结合的DNA区域才能够被多次捕获，那么捕获测序的DNA就会明显多于其他地方（即显著性堆叠），因此这些peak区域就可以推测为蛋白结合的DNA区域。那怎么找到peak呢，现在通用的就是利用MACS2软件进行call peak（具体MACS2的原理我们就不再解释了，简单说就是知道reads很多的地方）。

那么针对另外一个问题，怎么知道序列的特异性呢？就需要对peak进行motif（保守结合基序）的分析，常用软件包括Homer、MEME、MEME-ChIP等，都是很好的进行motif分析的工具，结果都是被认可的。拿到peak之后，我们就可以对peak进行关联基因，就可以知道结合DNA最有可能调控的基因是哪些，不过这个时候需要注意，因为转录因子结合DNA最终目的是调控基因表达的，那这些基因有没有差异表达呢？这个还是需要通过转录组的数据，随后和ChIP的数据联合分析才可以知道，对于联合分析结果进一步进行基因分析等，就可以进一步推测基因功能，并且和前期的功能验证实验结合更系统有力地阐述转录因子的功能。

最后就需要对ChIP等的结果进行验证了，一般是对重点关注的ChIP结合的DNA（或者说基因）进行验证，常用用的技术手段包括ChIP-qPCR、EMSA、酵母单杂、双荧光素酶等实验。这样就有更充分的证据来说明转录因子确实结合了关键性的基因区域，完成了转录因子调控该基因的表达的功能。

这时候，一个基本的文章就完成了，首先对转录因子进行了鉴定，对其“身份”信息进行了确定，随后对其表达模式进行了研究，并且通过敲除或者过表达验证其功能，紧接通过互作蛋白和结合DNA的鉴定，解释其机制，然后对重要基因进行验证，最终结合结果，发挥一下想象力，构建一个调控网络，一切完美。

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当时，转录因子功能的复杂性也远不止于此，先锋转录因子？转录因子和增强子？转录因子结合序列DNA甲基化选择性？这个也不可能只通过这一个思路就完成，我们有机会下次再聊，现在的思路也是一个敲门砖式的研究，推开这个大门，一点一点揭露其神秘面纱。不过，他山之石可以攻玉，我们也整理了一些转录因子研究可以用到的网站，包括动植物的已有的转录因子网站，转录因子抗体怎么选择，转录因子motif查询，已经做了的人和小鼠的ChIP数据怎么看，基因启动子区可能结合的转录因子预测等，关注爱基百客公众号，后台回复“ 转录因子 ”，我们整体打包给您，让您对手上的转录因子有个更清晰的认知。