文献解读 | 以Hi-C数据为核心，结合表观组学探究胰腺癌转移机制

基因组DNA是以多层级结构存在于细胞核内，这种压缩结构存在三维空间构象，可以在空间距离上拉近线性距离相距甚远的基因区域。这种染色质结构的特性导致许多增强子-启动子之间形成特殊的TAD和loop结构，从而维持生命体多样化的调控机制。Hi-C技术可以用于比较分析不同样本的三维结构变化，前期公众号我们对Hi-C的多组学框架进行了简单介绍，在此，小编通过一篇来自Journal of Hematology & Oncology（IF=17.388）的文章，向各位老师展示Hi-C如何联合表观组学进行3D基因结构的挖掘，并揭示癌症的转移调控机制。

文章标题

High-resolution Hi-C maps highlight multiscale 3D epigenome reprogramming during pancreatic cancer metastasis

研究背景

鉴于早诊困难以及远端转移现象，胰腺癌目前仍然是困扰临床治疗的致命的恶性肿瘤。远端转移患者的5年生存率仅为3%，远低于局部病灶患者，确定胰腺癌转移的基本机制将为其诊断和治疗提供有价值的信息。目前，许多表观修饰如DNA甲基化和组蛋白修饰已经揭示了部分胰腺癌的病理调控机制，然而，作为表观遗传信息的一个组成部分，染色质的3D组织及其在胰腺癌肿瘤转移过程中的重编程仍有待阐明。

为了研究胰腺癌转移的3D表观基因组特征，作者对源自原发部位和肝转移的正常胰腺和胰腺癌细胞进行了Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq和RNA-seq多组学分析。这些测序数据和综合分析能够开发胰腺癌转移全面的3D表观基因组图，研究隔室和接触域的表观遗传状态，以及识别和表征转移特异性增强子-启动子环。

技术路线

研究结果

1. 胰腺癌转移的染色体3D重编程

为了研究胰腺癌染色质的3D组织，作者对正常胰腺细胞（HPNE）、原位胰腺癌细胞（PANC-1）和肝转移胰腺癌细胞（Capan-1）进行了Hi-C实验和分析。此外，为了确定胰腺癌转移过程中的其他表观遗传特征，作者对这三类细胞进行了ATAC-seq（评估染色质可及性）、H3K27ac（活性增强子）、H3K4me3（活性启动子）、H3K9me3（异染色质）、H3K27me3（抑制区域）、H3K36me3（转录延伸区）和CTCF的ChIP-seq（确定调控元件）。最后为了评估染色质的3D组织与转录组之间的关系，作者对3个细胞系进行了RNA-seq。

首先，作者对4类测序技术分别进行了不同组间的相关热图展示，发现这4类测序数据具有一致性。其中，HPNE细胞与PANC-1细胞的3D表观基因组特征相似，但Capan-1表现出显著变化，暗示胰腺癌转移确实存在3D重编程。

2. 胰腺癌转移过程中的A/B区室重排

通过Hi-C Pearson相关矩阵分析发现，胰腺癌转移过程中，A/B区室转换显著，为了研究表观遗传特征在A/B区室转换之间的关联，作者利用组蛋白修饰的ChIP数据分析了跨区室的染色质可及性，与常规理解一致，A区室具有更高的活性组蛋白修饰状态。此外，转录组数据表明，位于从A到B的隔室中的基因表达趋于降低，而位于从B到A的隔室中的基因表达趋于增加。随后，作者对PC1值进行了聚类分析，发现正常/原发癌细胞的B区室转变为转移癌的A区室，位于其中的基因富含Ras/small GTPase相关的功能，表明A/B重排可能促进胰腺癌转移。

3. 胰腺癌转移过程中，接触域发生分裂

为了研究胰腺癌转移过程中的接触域变化，作者使用Arrowhead进行三组样本接触域的识别，发现转移癌细胞的接触域大小远小于正常/原发癌，但接触域边界数量增加，表明胰腺癌转移过程中新的接触域边界形成。此外，组蛋白修饰也随着胰腺癌转移发生与接触域趋向一致的变化，如组蛋白修饰ChIP分析发现转移癌中H3K27me3比例下降，表明非活性接触区域可能转变为活性接触区域，其中BCATA1基因在转移癌中位于新的H3K36me3接触区，这对重编程的分支链氨基酸代谢至关重要。

4. 胰腺癌转移过程中常见接触域的染色质状态发生变化

在证实了特定接触区域的染色质状态改变后，作者想知道在胰腺癌转移过程中，这些改变是否发生在常见的接触区域。作者提取了原发-转移的共同接触域中的基因，这些基因位于原发部位的H3K27me3修饰域，但位于转移的H3K36me3修饰域。基因表达检测和GO富集分析发现上调基因富集在血小板衍生的生长因子受体信号通路中，此外，TCGA数据库的Klaplan Meier分析发现这些基因的高表达与较差的存活率相关，表明共同接触域的染色质状态的改变也可以促进胰腺癌转移

5. 与胰腺癌转移和预后相关的特异性增强子-基因loop

为了研究与胰腺癌转移有关的关键染色质接触信息，作者使用HiCCUPS确定了正常、原发性和转移性癌细胞中的染色体内显著性loop，并将活性启动子、活性增强子和绝缘子重叠的loop定义为调节loop，并测试了细胞类型特异性增强子的基因表达。与原发癌细胞相比，大部分启动子与capan-1特异性增强子环连接的基因表达上调，同样，大部分启动子环化至初级特异性增强子的基因也表达上调，表明细胞类型特异性增强子有助于增加特异性基因表达。随后，作者对转移特异性增强子环化基因中显著上调的基因进行了功能富集分析，这些基因在细胞迁移和血管生成方面显著富集，表明这些基因与胰腺癌转移相关。随后，作者获取了TCGA队列中胰腺癌患者的基因集富集评分，Kaplan Meier分析显著这些基因的高表达与预后不良显著相关，表明胰腺癌转移过程中loop的改变可以上调转移相关基因。

前期利用Hi-C数据，作者确定了600多个具有loop重编程并与胰腺癌转移相关的基因，为了验证Hi-C的结果，作者分析了GEO数据库中原发癌与转移癌的差异基因，对Hi-C和转录组的结果进行重叠后，作者确定了3个关键基因，这些基因与Capan-1特异性增强子成环并在胰腺癌的远处转移组织中上调。其中，LIPC变化最大，作者基于H3K27ac的ChIP数据、ChIP-qPCR、3C-qPCR验证、Crispri系统发现了两个增强子在LIPC基因激活中发挥重要作用。

为了验证LIPC对胰腺癌转移的影响，作者对LIPC进行了过表达和敲除，细胞的伤口愈合试验和transwell试验表明LIPC的过表达促进了胰腺癌细胞的迁移和侵袭，小鼠肿瘤的模型实验以及转移肿瘤的IHC实验也验证了这一点。

6. 与启动子成环的转移特异性增强子相关的转录因子

Hi-C、ChIP与转录组数据已经证明了部分与转移特异性增强子成环的基因与胰腺癌转移相关，但转录因子（TF）在其中对于增强子-启动子loop的形成的作用仍不太明确。对此，作者利用ATAC-seq对每个细胞类型特异性增强子和相应启动子中的核小体耗尽区（NDR）进行了识别，随后对转移特异性增强子NDR进行了motif分析和转录因子预测，发现KLF5 motif在转移特异性增强子和相应的启动子处富集。此外，TCGA数据证实KLF5高表达与胰腺癌不良预后有关。随后，利用多组学数据，找到了仅在转移癌中存在的连接KLF5启动子的增强子。这些结果表明，转移特异性增强子能够与几个关键转录因子的启动子形成loop，从而介导增强子-启动子loop上调胰腺癌转移的相关基因。

文章总结：

本文报道了胰腺癌转移中最全面的3D表观基因组研究，并确定了促进胰腺癌转移的候选基因。这为胰腺癌研究界提供了重要资源，并为胰腺癌病理生物学提供了新的见解，Hi-C技术在其中起到了不可或缺的作用。

原文链接：

https://jhoonline.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13045-021-01131-0