客户文章 | ChIP-seq助力猪骨骼肌产前发育过程中染色质结构重组的研究

发表单位：中山大学

发表日期：2021年5月2日

期   刊：DNA Research（IF: 4.477）

2021年5月2日，中山大学生命科学学院莫德林教授课题组在DNA Research （IF=4.477）上在线发表了题为“Reorganization of chromatin architecture during prenatal development of porcine skeletal Muscle”的研究论文。作者通过对胚胎第35天(E35)、E80的猪背最长肌组织基因组3D结构和转录组特征进行整合分析，揭示了E35到E80阶段中骨骼肌染色质结构重组过程。爱基百客为该研究提供ChIP-seq技术支持。

一、研究背景

骨骼肌是最具活力的组织之一，约占体重的40%，能够分解能量物质(葡萄糖、氨基酸和脂肪酸)，产生维持姿势和运动所需的化学能。农业动物(猪、肉牛、肉鸡)的骨骼肌是人类食用的重要膳食蛋白质来源。当胚胎肌肉发育、出生后生长和再生过程遭到破坏时，会导致各种肌肉功能障碍，包括肌肉萎缩和肌肉营养不良。

鉴于骨骼肌在许多方面的重要性，全面了解骨骼肌发展对骨骼肌生物学研究以及提高牲畜肉类产量尤为重要。越来越多的证据表明，真核生物的基因组在细胞核中形成了一个高度有序的层次结构，它与转录机制密切相关，甚至可能与转录存在直接因果联系。破译骨骼肌发育过程中染色质结构的重组有助于解释在肌源性分化中的复杂分子调控机制。

莫德林课题组首次对猪胚胎第35天(E35)-E80时期中背最长肌（LDM）的基因组进行了3D结构和转录组特征分析。旨在构建猪骨骼肌基因组的三维图谱，探讨基因组空间结构在发育过程中的动态变化，并在次级肌纤维形成阶段中分析基因组结构和基因表达之间调控关系。

二、文章思路

三、研究材料及方法

材料：陆川猪雌性胚胎不同发育阶段（35d、80d）中背最长肌组织。

方法：

1. 采用Hi-C技术来捕获肌肉组织中原位高通量染色质构象；

2. 采用ChIP-seq技术找到H3K27AC组蛋白区域，筛选超级增强子和常规增强子；

3. 采用RNA-seq技术对肌肉组织中mRNA水平进行分析。

四、研究结果

4.1骨骼肌发育过程中动态染色质区室

为了研究哺乳动物肌肉细胞中的染色质组织，作者分别构建了E35和E80的猪背最长肌Hi-C文库。相较于E35肌肉组织而言，E80肌肉组织中染色质区室程度更明显。在胚胎发育过程中，基因组中有4.39%从区室A状态转变为了区室B，有7.04%从区室B状态变成A，分别伴随着329个基因表达量下降和1284个基因表达量上升，这些基因参与了发育、生长、代谢等途径，其中最为典型3个基因分别是NEFL、SLN和MYL1。

图1  染色质区室A/B变化

4.2 拓扑结构域（TAD）内部动态互作与转录、区室化联系

锌指转录因子（CTCF）大量富集在TAD边界区域。在E35、E80两个时期 中TAD边界基本不变，仅仅只有2%存在差异，说明TAD是一个较为保守结构域。虽然TAD边界稳定，但其内部的互作是一个动态过程。TAD内部互作程度增强其相关基因表达水平会出现上升趋势，且与A-B指数呈现正相关。

作者通过研究发现在E35和E80胚胎肌肉组织中，有531个TADs内部互作存在差异。与E80相比，E35时期有483个TADs具有较高内部互作，表现出更加活跃区室状态并伴随1417个基因表达上调，这些基因主要富集在形态发生和突触相关通路中。相较于E35，E80时期存在48个TADs具有较高内部互作，表现出更加活跃区室状态并伴随133基因表达上调，这些基因主要富集在骨骼肌发育与代谢通路中。

图2发育过程中TAD内部动态变化

4.3 启动子-增强子相互作用(PEI)在骨骼肌发育中的重组

作者通过实验证明在E35时期中13548个基因共出现48909次PEIs，在E80时期中发现了12993基因共出现54350次PEIs。基因表达水平会随着互作增强子数量增加而上升，说明增强子数量对于靶基因表达水平具有一定影响。作者通过采用调控潜能得分(RPS)来探究多重增强子对基因调控效应，并统计在基因调控过程中增强子互作次数。结果显示基因表达水平上升会伴随着RPS增加。除此之外，增强子活性也是基因表达一种重要调控因素。H3K27ac通常用于标注已激活增强子并根据ChIP-seq信号将其分为常规增强子（RE）和超级增强子（SE），而不含H3K27ac的增强子被认为是平衡增强子（PE）。结果发现RPS与H3K27ac富集程度呈正相关。基因启动子分别与超级增强子、常规增强子及平衡增强子互作时，其表达量依次降低。

在肌肉发育过程中有951基因存在PEIs重组，其中有307个基因互作减弱表达量降低，另外644个基因相互增强且表达量增强。由于RPS不包含增强子活性对基因表达影响。因此，作者检测了与基因启动子（RPS无差异）相互作用的远端增强子区域H3K27ac富集程度，结果显示在E35期有493个基因远端增强子存在H3K27ac高度富集，而在E80期有1179个基因远端增强子存在H3K27ac高度富集，结果显示与启动子互作的增强子活性与基因表达呈明显正相关。随后将E35到E80阶段中RPS、增强子活性增加或减少基因分别进行统计。E35时中具有高RPS和增强子活性的基因主要富集在形态和神经元分化的相关通路中，其中MuSK是神经-肌肉节点（NMJ）发育过程中重要基因，在初级肌小管中高表达但在骨骼肌中呈现低表达。在E80期肌肉组织中MuSK表达量明显低于E35期，其增强子活性也随之减弱。

在E80期，具有较高RPS和增强子活性的基因主要富集在骨骼系统发育、肌肉结构发育、细胞外结构组织等途径中，其中Sox6和MATN2两种基因在及时诱导肌肉发生的全局转换中起着至关重要的作用。E80期中Sox6、MATN2基因表达水平、增强子活性及互作增强子数量均明显高于E35期，这有可能是肌细胞分化成肌纤维重要原因。

图3 PEIs调节基因表达

图4 在E35-E80期间PEIs重组