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文献解读 | 7分+，病原细菌sRNA致病新机制今天带来的是2021年7月发表在PLoS Pathog的一篇sRNA研究的文章，由上海交通大学农业与生物学院朱勃、陈功友联合团队发表，题为“A key antisense sRNA modulates the oxidative stress response and virulence in Xanthomonas oryzae pv. oryzicola”。该研究主要探讨了黄单胞菌属Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc)中sRNA适应氧化应激环境下对水稻致病性的研究机制。
发表单位：上海交通大学 发表日期：2021年7月23日 期 刊：PLoS Pathog（IF:7.464） 研究背景 细菌病原体可以通过改变转录调控因子的活性和数量来适应应激条件。调控蛋白可能在转录水平上被调控，或受到翻译后修饰，如磷酸化和糖基化。此外，sRNA分子通过碱基配对在转录后水平靶向mRNA，能够全局上调控基因表达；最终控制了靶基因的表达，并能影响毒性。 研究思路
研究结果 1. sRNA Xonc3711靶向xoc_3982 mRNA 此前对sRNA-Xoo1的研究结果表明，该小RNA的表达或稳定性依赖于RNA伴侣Hfq。因此，作者首先使用EMSA评估在体外Xonc3711是否与Hfq互作。EMSA明确表明生物素化的Xonc3711与Hfq之间存在强相互作用（图1A）。为了评估Hfq是否影响Xonc3711的转录，比较野生型（BL526）、hfq缺失突变体(Δhfq)和Xonc3711突变体中(ΔXonc3711)的表达情况（图1B）。Δhfq突变体中Xonc3711的转录量大幅下降，说明Hfq参与了sRNA Xonc3711 的表达。 以Xonc3711序列为查询对象，以Xoc BLS256基因组为目标，用CopraRNA算法对Xonc3711的靶蛋白进行检索。筛到了一个DNA结合蛋白Xoc_3982。为了确定Xonc3711是否与Xoc_3982是否互作，在Xoc BL256（WT）和ΔXonc3711突变体中评估xoc_3982的表达，Xoc BL256（WT）是一个超表达Xonc3711的菌（Xonc377OE）（图1C）。Western blot分析显示Xoc_3982蛋白水平在ΔXonc3711突变体中偏高，超表达Xoc_3911会导致Xoc_3982蛋白水平的减少。Northern blot结果与western分析结果相关，显示ΔXonc3711突变体中xoc_3982转录本表达升高。
图1 sRNA Xonc3711结合Hfq并且靶向XocBLS256中的Xoc_3982mRNA 2. xoc_3982转录后调控 Hfq依赖的sRNAs通过几种方法激活或抑制mRNA靶点。作者预测xoc_3982 mRNA靶序列的14-59核苷酸与Xonc3711种子区互补（图2A）。为了验证这一假设，xoc_3982的起始密码子翻译融合绿色荧光蛋白（GFP），产生载体X+3（图2B）。由于带上这种融合后RNA和Xoc_3982蛋白水平仍然保持不变，Xonc3711未能成功调控X+3报告子（图2C）。当Xonc3711与X+1242报告基因融合配对时，RNA水平保持不变，但相对于对照组，Xoc3982蛋白水平被抑制；这一结果支持作者的预测——Xonc3711靶定xoc_3982CDS的一个区域。 此外,生物素化的Xonc3711与全长xoc_3982 mRNA在凝胶移位实验中相互作用（图2D）。这些发现暗示xoc_3982是sRNA Xonc3711的靶目标，它在通过与xoc_3982 CDS碱基配对调控转录后的xoc_3982 mRNA。
图2 分析Xonc3711-xoc_3982 RNA互作 3. 短CDS配对对xoc_3982抑制至关重要 作者通过代偿点突变在体内验证了Xonc3711-Xoc3982的相互作用。突变体Xonc3711*中，UGC核苷酸突变为CAA，而xoc_3982*中ACG核苷酸突变为GTT（图2A）。与预测的一样，相对于缺失突变体，Xonc3711抑制了xoc_3982的表达（图3）；相对于WT，Xonc3711*对xoc_3982的抑制能力减弱（图3A）。在含有Xonc3711的野生型中，xoc_3982*的表达仅略有下降（图3A）。然而，当Xonc3711和xoc_3982的代偿突变相互作用时，却观察到高水平的xoc_3982抑制。
图3 体内Xonc3711-xoc_3982 RNA相互作用的验证和降解RNase E的需求 4. xonc3711依赖的xoc_3982降解需要RNase E 核糖核酸酶RNase E是sRNA加工和周转的关键酶。为了更好地理解sRNA依赖性的xoc_3982 mRNA降解，作者探索了RNase E在Xonc3711-xoc_3982衰变中的作用。构建缺失突变体，再利用northern blot和western blot分析突变体和野生型蛋白水平，结果暗示RNaseE促进xonc3711介导的xoc_3982降解。 5. Xonc3711突变体对氧化胁迫的耐受能力下降 Xoc BLS256暴露在0.1mMH2O2条件下后0、7、15和45分钟检测Xonc3711的表达。Xonc3711在15 min时间点转录水平最高，提示Xonc3711表达是氧化应激诱导的。为了进一步研究Xonc3711在氧化胁迫中的潜在作用，作者比较了选定菌株在NB培养基中存在和不存在0.1 mM H2O2时的生长情况（图4）。 菌株生长在没有H2O2的培养基表现出相同的生长模式（图4A）；然而，在有0.1mM H2O2的NB上生长的ΔXonc3711和ΔXoc_3982 突变体可以观察到8h的生长延迟（图4B）。对几个菌株的OD值和生长条件进行分析，结果暗示sRNA Xonc3711与DNA结合蛋白Xoc_3982互作帮助Xoc BLS256适应氧胁迫。
图4 Xonc3711、xoc_3982和fliC的突变降低了氧化应激的耐受性 6. Xonc3711影响鞭毛结构，减少生物膜的形成 通过RNA-seq比较WT和ΔXonc3711，进一步了解sRNA Xonc3711在氧化应激耐受中的作用。ΔXonc3711中有大量基因表达下调，包括与鞭毛组装、基体形成、鞭毛运动相关的基因以及t3ss相关基因。多个基因参与鞭毛的合成和组装，包括filC、fliF、fliM、flgA、flhA和flhB，与野生比较它们在ΔXonc3711 突变体中下调表达（图4D）。有趣的是，与WT相比，ΔXonc3711中编码鞭毛丝结构蛋白的fliC的表达大约降低了8倍。体外生长曲线显示，fliC突变体对H2O2的耐受性低于野生型，在氧化胁迫下fliC突变体的生长与ΔXonc3711相似。这些结果表明，Xonc3711对鞭毛的结构有影响。 突变体ΔXonc3711和ΔXoc_3982 产生比野生型少的鞭毛（图5A，B和C）。ΔXonc3711突变体的鞭毛显著短于WT（图5E）。用一个fliC缺失突变(ΔfliC)作为对照，结果如预期的那样没有鞭毛。这些结果表明，Xonc3711和xoc_3982突变都影响鞭毛的合成和结构。 之前的研究表明，鞭毛驱动的运动促进生物膜的形成，这有助于氧化应激耐受。作者的研究结果表明Xonc3711参与氧化应激和运动；作者于是使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和3D串行层扫描来测量生物膜的形成。突变体ΔXonc3711与WT相比，其粘附玻璃表面的能力受损，荧光减弱（图6）。这些结果证实了sRNA Xonc3711与Xoc能动性和生物膜形成的关系。
图5 Xonc3711和xoc_3982突变减少鞭毛数目和长度
图6 Xonc3711参与生物膜的形成 7. Xonc3711过表达有助于提高毒力 为了评估Xonc3711对毒力的潜在贡献，对6周的水稻“Yuanfengzao”的叶子接种野生型菌、突变体ΔXonc3711、ΔXoc_3982和Xonc3711OE（图7A）。接种14天后，Xonc3711OE诱导的病变明显大于WT和ΔXonc3711（图7B）。ΔXoc_3982突变体表现出更高的毒力，产生的病变比WT和ΔXonc3711略大。因此，结果表明Xonc3711对Xoc BLS256的毒力有贡献。
图7 毒力和水稻生长情况 8. Xoc_3982直接调控由xopC2编码的效应器 利用NCBI保守结构域数据库分析Xoc_3982蛋白，结果暗示Xoc_3982是一个潜在的DNA结合蛋白，与SAM家族的DNA修饰/修复蛋白有亲缘关系。xoc_3982::GFP 融合 X+3（pKMS1::X+3）被转入Xoc BLS256，利用ChIP-seq鉴定由Xoc_3982调控的基因。结果表明，Xoc_3982的潜在靶标为hemF、xdhC、xpsE、xopC2和mutM；这些基因包含一个保守序列5’-CGCTTTT-3’（图8A）。作者对xopC2特别感兴趣，它编码了一个T3SS效应器，已经在许多黄单胞菌属(包括Xoc BLS256)中被识别出来，它对X. axonopodis pv. Punicae的毒力功能有重要作用。 RNA-seq数据显示与野生型比较xopC2在ΔXonc3711突变体中是下调表达。推测的Xoc_3982结合位点位于xopC2启动子的相对于翻译起始位点-334 -327位置。EMSA证实Xoc_3982与xopC2的启动子互作。当xopC2启动子发生突变时，相互作用被中断（图8B）。ΔXoc_3982突变体中xopC2的相对表达量显著高于WT，这说明Xoc_3982是xopC2的负调控因子（图8C）。此外，与野生型相比，ΔXopC2菌株的毒力下调（图7），这暗示xopC2对Xoc BLS256的毒力有一定的贡献。
图8 Xoc_3982鉴定到一个保守的motif，并且调控效应器基因xopC2 总结sRNA Xonc3711通过与xoc3982转录本碱基配对减少黄单胞菌属Xoc 的DNA结合蛋白Xoc3982的产量。当Xonc3711突变后，Xoc形成鞭毛和产生生物膜的能力受损，降低了Xoc对氧化应激的耐受性。DNA结合蛋白Xoc_3982可以抑制效应蛋白xopC2的表达，降低其表达。Xonc3711通过调节和整合Xoc中的多个系统来保护细胞免受氧化损伤。该研究描述了sRNA Xonc3711是如何通过外部环境信号调节Xoc中的多种性状，为了解细菌生理和发病机制中RNA介导的环境信号调节提供了新的思路。 往期推荐：
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