客户文章 | ChIP-seq和RNA-seq联合分析揭示了拟南芥FOUR LIPS在水稻盐胁迫应答中的作用

2022年5月18日中国科学院植物研究所植物分子生理重点实验室乐捷团队在Plant Molecular Biology上发表一篇名为“Transcriptomic analysis reveals the role of FOUR LIPS in response to salt stress in rice”的研究论文。作者通过RNA-seq和ChIP-seq技术探讨OsFLP在水稻中的潜在作用。结果表明，水稻OsFLP可能是一个参与水稻生长发育和胁迫响应诸多生物学过程的多功能调控因子。这项研究揭示了OsFLP在水稻耐盐性中调控OsCDKB1;1的关键功能，并在很大程度上扩展了关于OsFLP在水稻中作用的机制。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。

盐胁迫是影响植物生长发育的重要环境因子，导致作物减产。为了适应不利的环境条件，植物进化出了保护自己免受胁迫的分子机制。因此，揭示盐胁迫响应机制将有利于提高植物的耐盐性，进而提高作物产量，确保全球人口快速增长的粮食安全。盐胁迫响应机制与植物的气孔发育调节基因有着密切关系。在拟南芥中，FOUR LIPS (AtFLP)是一个非典型的R2R3-MYB转录因子，在气孔发育中起调节作用。作者通过基因编辑系统敲除水稻AtFLP的同源基因OsFLP获得突变株系。与拟南芥不同，水稻守护母细胞的对称分裂需要OsFLP的作用。然而，人们对于OsFLP的功能和下游目标知之甚少。因此，研究OsFLP在水稻盐胁迫应答中的作用至关重要。

图1 Osflp的表征

为了便于对OsFLP进行功能分析，作者获得了一个基于基因敲除系统的osflp突变株系。结果表明， osflp 突变体第六个外显子中的 Ala 被 Thr 取代导致叶片中 GCs 发育异常。在 osflp 中，在 GMC 细胞分裂后，细胞板的方向错位在多个方向上，并且保卫细胞(图 1A-E）。

为了探究OsFLP的潜在功能，作者对正常生长条件下的7日龄幼苗和野生型ZH11的嫩枝进行了RNA-seq分析。作者共鉴定出755个差异表达基因(DEGs)，其中osflp突变体与ZH11相比有328个上调基因和427个下调基因(图2A)。结果表明OsFLP可能参与植物发育和环境胁迫反应的各个方面。为了进一步揭示OsFLP的功能，作者分别对上调和下调的DEGs进行了基因本体(GO)分析。GO分析显示，与过氧化物酶活性、氧化应激活性氧代谢过程等相关的GO项中，除上调的DEGs外，下调的DEGs显著富集(图2C)。 

此外，作者还使用OsFLP中的pOsFLP::OsFLP- MYC进行ChIP-seq分析。KEGG通路分析显示，OsFLP的潜在直接靶点涉及多个通路，包括“剪接体”、“mRNA监视通路”、“n -聚糖生物合成”、“内吞作用”、“RNA转运”、“氧化磷酸化”等(图2D)。其中，氧化磷酸化与ROS（活性氧）代谢密切相关。通过对RNA-seq数据和ChIP-seq数据的综合分析，作者发现有125个基因同时存在于RNA-seq和ChIP-seq谱中(图2E)。这一结果提示OsFLP可能参与ROS代谢。在盐胁迫条件下，与ZH11和COM（互补株）相比，这4个基因在水稻osflp中的表达显著降低，而在OE中的表达增加(图2F-I)。综上所述，OsFLP影响了盐胁迫应答基因和ROS代谢基因的表达，提示OsFLP可能参与了盐胁迫应答。

    为了证实OsFLP在响应盐胁迫中起着重要作用，作者对ZH11，COM，osflp和OE植株进行了盐胁迫实验。在150 mM NaCl胁迫下，ZH11和COM的发芽率几乎达到100%，而在osflp下，发芽率要低得多，5 d后约为53%。在200 mM NaCl胁迫下，osflp的根和芽均较ZH11和COM短。相比之下，在过表达OsFLP的植株(OE)中，观察到茎尖和根长显著增加(图3A-C)。为了进一步证实OsFLP的盐响应功能，作者对土壤栽培植物进行了表型分析。3周龄幼苗分别用200 mM NaCl处理15 d和21 d。osflp表现出较高的敏感性，存活率(约18.75%)显著低于ZH11(约87.5%)，COM植株能够表现出较高的耐盐性，存活率约为81.25%，而OE植株对盐胁迫的抗性更高，存活率为100%(图3D, E)。综上所示，osflp在水稻盐胁迫响应中发挥正向调控作用。

图4  盐胁迫条件下，水稻osflp突变体积累了较多的ROS

    盐胁迫通常会导致植物体内ROS积累。高浓度的ROS会导致膜(脂质过氧化)、蛋白质、RNA和DNA分子的氧化损伤。通过转录组分析结果显示，许多参与ROS代谢的基因被富集(图2C)。因此，作者研究了盐胁迫条件下osflp和OE植株的ROS稳态是否受到影响。2周龄的ZH11、osflp、COM和OE幼苗分别用150mm NaCl处理3 d和不处理10 d，恢复3 d(图4A)。此外，作者还检测了ZH11、osflp、OE和COM的SOD、POD和CAT酶活性。在无盐处理条件下，osflp和OE中这些酶的活性与ZH11和COM非常相似。然而，在盐胁迫下，这些酶的活性在osflp中显著降低，而在OE中增强(图4D-F)。另外，在盐处理条件下，osflp中H2O2积累较多，OE中H2O2积累较少(图4G)。二氨基联苯胺(DAB)和硝基蓝四唑铵(NBT)染色也一致证实，相对于ZH11和COM, osflp中ROS含量更高(图4H, I)。综上所述，这些结果表明OsFLP通过影响ROS积累来应对盐胁迫。

在盐胁迫条件下，细胞内Na+和K+的稳态对细胞活动至关重要，对植物的耐盐性至关重要。为了检测盐胁迫下osflp突变体和OE株系Na+和K+的动态平衡是否发生变化，作者测定测定了幼苗茎叶和根系Na+和K+的含量。结果表明，在NaCl处理下，osflp中地上部和根部的Na+/K+比值升高，而OE株系中Na+/K+比值降低(图5C, F)。这表明在盐胁迫条件下，osflp突变体中积累了过量的Na+。

图6  OsFLP直接与OsCDKB1:1启动子区结合，调控其转录表达

图7  OsCDKB1;1负向调控水稻对盐胁迫的响应