项目文章 | IF>9 ！ChIP-seq和RNA-seq联合分析揭示 NrtR介导的铜绿假单胞菌H1-T6SS调控

发表单位：南开大学生命科学学院

发表日期：2022年2月23日

发表期刊：Microbiol Spectr（IF：9.043）

研究材料：铜绿假单胞菌

研究技术：ChIP-seq、RNA-seq、EMSA等（爱基百客均可提供）

2022年2月23日南开大学生命科学学院在期刊Microbiol Spectr（IF：9.043）发表题为“NrtR Mediated Regulation of H1-T6SS in Pseudomonas aeruginosa”的研究论文。该研究利用ChIP-seq技术证明NrtR通过直接结合tssA1启动子以及通过RsmY/RsmZ-RsmA/RsmN通路调控H1-T6SS基因的表达。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。

1. nrtR突变使铜绿假单胞菌H1-T6SS基因表达增加

为了确定nrtR在铜绿假单胞菌中的全局调控作用，作者利用RNA-seq比较分析野生型菌株PAK和它的△nrtR突变体的全局转录组。转录组分析结果显示△nrtR突变体中H1-T6SS操纵子的大部分基因以及它的分散效应器/免疫蛋白上调表达（表1）。

为了了解nrtR与铜绿假单胞菌H1-T6SS基因之间的关系，作者采用real-time qPCR验证Hcp-编码基因（铜绿假单胞菌H1-T6SS的标记基因）的mRNA水平（图1）。△nrtR突变体中hcp1 mRNA的水平增长了6.1倍，并且可以与野生型nrtR基因互作恢复到野生型PAK菌株的水平。蛋白实验也进一步支持这一结果（图1B）。作者还做了细菌竞争分析，比较了铜绿假单胞菌和大肠杆菌竞争生长的情况。这些结果证实nrtR突变使铜绿假单胞菌H1-T6SS基因表达增加。

2. rsmY/rsmZ上调导致△nrtR突变体中的H1-T6SS增加

由于NrtR通过控制cAMP/Vfr途径控制T3SS的表达，作者想知道△nrtR突变体中的H1-T6SS的增加是否由于细胞cAMP水平的降低。为了验证这一点，作者检测了突变体△cyaA△cyaB和△vfr中H1-T6SS的表达情况，这些突变体也表现出细胞内cAMD含量减少。Real-time qPCR结果显示与野生型比较这两个突变体中hcp1和tssA1都表现出mRNA水平减少。这些结果表明H1-T6SS的上调并不是因为△nrtR突变体中的cAMP水平减少。

铜绿假单胞菌中H1-T6SS的表达被证明是受细胞内c-di-GMP控制，它与cAMP信号通路有关。作者此前报道过△nrtR突变体cAMP水平显著降低；因此，作者想研究ntrR是否影响细胞内c-di-GMP水平。表面粘附CdrA的表达受细胞内c-di-GMP的调控；因此，其表达水平被作为细胞内c-di-GMP水平的指标。Real-time qPCR结果表明NrtR对铜绿假单胞菌细胞内的c-di-GMP的水平没有影响。

铜绿假单胞菌中小RNAs RsmY和RsmZ调控H1-T6SS的表达。为了验证nrtR是否通过RsmY和RsmZ抑制H1-T6SS，作者比较了突变体中这些sRNAs的mRNA水平以及EGFP蛋白水平。结果暗示在△nrtR突变体中RsmY和RsmZ表达上调（图2B）。

图2 RsmY/RsmZ上调导致△nrtR突变体的H1-T6SS升高

为了验证RsmY和RsmZ对NrtR介导的H1-T6SS的调控作用，作者构建了△nrtR△rsmY和△nrtR△rsmZ双突变体，以及△nrtR△rsmY△rsmZ三突变体，并检查它们的H1-T6SS表达。Real-time qPCR和蛋白表达实验结果暗示NrtR通过小RNAs RsmY和RsmZ抑制H1-T6SS。

3. △nrtR突变体中超表达rsmA/rsmN可恢复H1-T6SS的表达

由于RsmY和RsmZ的主要作用是隔离和降低自由RsmA和RsmN，它们是两个CsrA家族RNA结合蛋白，作者研究了RsmA和RsmN的异位表达是否可以恢复△nrtR突变体中的H1-T6SS表达。首先，real-time qPCR用来确定hcp1的转录水平。如预期，超表达rsmA或rsmN可降低△nrtR突变体中相对mRNA水平（图3A和B）。

此外，带Flag标签hcp1转入PAK和它的△nrtR衍生菌。Western blot检测Hcp1的表达。与real-time qPCR结果一致，超表达rsmA或rsmN会降低△nrtR突变体中Hcp1-Flag的数量（图3C）。这些结果暗示NrtR影响RsmA/RsmN介导的H1-T6SS调控。

图3 △nrtR突变体中超表达rsmA/rsmN可恢复H1-T6SS的表达

4. NrtR直接结合rsmY/rsmZ的启动子

为了了解NrtR介导的rsmY/rsmZ调控，作者进一步研究了NrtR是否影响rsmY/rsmZ基因上游的已知调控基因的表达，如gacA、gacS、ladS、retS、algR和amrZ。RNA-seq分析和real-time qPCR结果表明这些基因的mRNA水平并没有改变。

为了进一步阐明NrtR调控rsmY/rsmZ的分子机制，作者进行了ChIP-seq分析。首先，构建了一个表达质粒——pUCP24-nrtR，它能够恢复△nrtR突变体中H1-T6SS的表达。然后，对包含这个表达质粒的△nrtR突变体进行ChIP-seq。与此前的报道结果一致，NrtR结合到nadD2和pcnA之间的基因间区（表2），基因间区富集倍数是2.21倍。值得注意的是，NrtR的潜在结合靶点包括rsmY和rsmZ基因的上游序列（表2）。EMSA结果进一步验证NrtR与候选启动子区域的结合。

图4 NrtR直接结合rsmY、rsmZ或tssA1的启动子。EMSA检测确定NrtR与nadD2（A）、rsmZ（B）、rsmY（C）、tssA1（D）或NrtR内部区域。

5. NrtR直接结合tssA1启动子并抑制tssA1的表达

除了rsmY和rsmZ，作者的ChIP-seq数据显示tssA1的启动子也是NrtR的潜在结合靶点（表2）。根据RNA-seq分析结果（表1），△nrtR突变体中tssA1的转录水平增长了9.6倍。因此，NrtR可能直接结合到tssA1启动子并抑制其表达。为了验证这种推论，作者首先利用实时qPCR证实了△nrtR突变体中tssA1转录水平的增长。结果与RNA-seq的结果一致（图5A）。在△nrtR突变体背景下，PtssA1介导的EGFP蛋白水平与mRNA表达水平一致（图5B）。

为了进一步证实NrtR对tssA1的直接抑制，nrtR克隆进pET28a并与PtssA1-EGFP共转入大肠杆菌BL21。实时qPCR和western结果暗示NrtR对tssA1的直接抑制作用。为了进一步验证NrtR与tssA1启动子区域的直接结合，作者使用tssA1启动子区域对应的片段进行了EMSA。类似于rsmY和rsmZ，与NrtR孵育后，tssA1启动子区域检测到一条延迟带，但NrtR的DNA片段没有(图4)，表明NrtR特异性结合H1-T6SS操纵子的启动子区域。

图5 NrtR直接抑制tssA1