从文献看如何研究转录因子——锌指蛋白SIZF3负调控番茄株高的分子机理

转录因子(transcription factor)是一类能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。典型的转录因子包含DNA结合结构域和转录调控结构域，通过DNA结合域结合到目标基因的启动子区域，然后通过转录调控结构域激活或者抑制目标基因的表达。生物体内有许多转录因子家族，一般同一家族的转录因子具有保守的DNA结合结构域。转录因子主要通过调控下游基因的表达来发挥具体生物学功能，因此对转录因子结合的DNA序列的预测和分析有助于对其功能研究。常见的研究思路如下：

我们从一篇文章来看一下研究转录因子的具体研究方法和分析思路。

2023年2月，华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验番茄团队在Horticulture Research发表的题为SlZF3 regulates tomato plant height by directly repressing SlGA20ox4 in gibberellic acid biosynthesis pathway 的研究论文。

株高是作物最重要的农艺性状之一，这一点在谷物作物的“绿色革命”中尤为明显。它影响作物结构、土地利用、营养和生产管理。株高由许多基因控制，尤其是与植物激素生物合成或信号转导有关的基因，包括赤霉酸（GA）、生长素、油菜素甾体（BR）和三羟内酯（SL）。番茄作为世界上最重要的蔬菜作物之一，其株高的调控机制还有待深入研究。该团队前期研究揭示了SlZF3参与调控番茄耐盐性的功能和分子机理（Li et al., Plant Biotechnol. J., 2018）。过表达SlZF3还可导致番茄矮化，本研究旨在解析调控株高的分子机制。

1.SlZF3在番茄不同组织和不同激素处理条件下表达情况

通过RT-PCR检测SlZF3在组织中的表达情况，结果表明，SlZF3在检测的组织中呈组成型表达，在不同发育阶段的果实中表达量较高(图1a)。许多研究表明，矮化通常与植物激素有关，如GA。因此，作者研究了不同激素(包括GA3、IAA、ETH和ABA)处理下SlZF3的表达。结果发现，SlZF3对测试的四种激素都有反应。在GA3和IAA处理下，SlZF3表达模式相似，在12 h和24 h显著上调，但在6 h和48 h下调(图1b, d)。在ETH处理下，转录物在12 h显著上调，但在3 h和48 h下调(图1c)。在ABA处理下，SlZF3在大多数测试时间点都被抑制，然而，它在48小时上调了大约5倍(图1e)。总之，SlZF3在不同组织中都是组成性表达，在叶片中的表达可以受到包括GA在内不同激素的诱导。

图1. SlZF3在番茄不同组织中的转录水平和对激素处理的反应

2.SIZF3过表达番茄系的半矮化表型

初步观察表明，SlZF3过表达系是半矮化的。作者测量了6周龄SlZF3过表达株系和SlZF3 RNAi株系的株高。过表达株系明显比野生型AC株系矮，而RNAi株系（RiZF3）比野生型AC株系高（图2a）。对于6周龄的幼苗，野生型株系的高度为21.3厘米，而过表达系株系的高度仅为野生型的40%左右。同时，RNAi株高明显更高（图2b）。株高的变化可能是由于节间数量或节间长度的变化。作者进一步检查了所有测试株系的这两个参数。在节间数量上没有发现差异（图2c），然而，过表达系的节间长度比野生型短得多（图2d）。为了进一步检查短节间是否是因为细胞长度的减少，作者从底部选择了第四个节间，并用显微镜检查了中间部分。结果显示，与AC相比，过表达株系中的干细胞长度显著减少，但在RNAi株系中增加（图2e-f）。因此，干细胞长度的改变是SlZF3转基因株系株高变化的主要原因。

图2. SlZF3的过表达限制了番茄植株的节间伸长

3.SlZF3通过赤霉酸（GA）途径调节番茄矮化

许多研究表明，GA与株高和叶片扩展的调节密切相关。此外，SlZF3的表达数据显示其可被GA3诱导（图1b）。因此，作者检测了SlZF3过表达引起的矮化植物中GA水平是否发生变化。LC-MS结果显示，与AC相比，SlZF3过表达株系中GA4、GA8、GA9和GA29的含量显著降低（图3a）。这表明SlZF3通过GA途径调节了番茄发育。为了验证这一点，检测了外源GA是否可以挽救过表达系的矮化表型。用100μM外源GA处理，结果表明，SlZF3过表达植物的高度基本恢复到跟野生型一致（图3b，3c），这表明SlZF3通过GA合成途径而不是GA信号调节番茄植株高度。

为了鉴定SlZF3的潜在靶基因，作者进一步检测了参与GA生物合成途径的代表性基因的转录水平。研究发现，在过表达株系中，KS、KO、SlGA20ox4和SlGA3ox1的转录物显著减少，而KAO、SlGA20 ox1、SlGA 20 ox2、SlGA 20ox3和SlGA3 ox2的转录物则显著增加（图3d）。在四个GA氧化酶基因中，只有SlGA20ox4的表达降低，而在RNAi系中也显示出相反的表达模式。其表达的减少与SlZF3过表达系中GA4水平低于AC的结果一致（图3a）。此外，SlZF3极有可能作为转录抑制因子，因为它的C末端有一个EAR基序，这也与过表达系中SlGA20ox4的下调一致。此外，先前的研究也支持GA氧化酶的下调导致植物矮化。作者假设SlGA20ox4可能是SlZF3的靶点，尽管不能排除上游的SlKS和SlKO也可能是推定的靶点。

4.SIZF3通过启动子结合抑制SlGA20ox4的表达

为了验证作者的假设，作者进行了一系列生化实验来研究SlZF3和SlGA20ox4启动子的相互作用。首先，进行酵母单杂交分析以检查SlZF3是否能够与SlGA20ox4的启动子结合。与AD-SlZF3和pAbAi-ProSlGA20ox4共转化的酵母细胞以及阳性对照可以在含有AbA的选择性培养基（SD Leu-Ura）中生长，但阴性对照没有显示生长（图4a）。这一结果表明，SlZF3可以与酵母细胞中的SlGA20ox4启动子相互作用。然后，进行荧光素酶测定以测试SlZF3是否可以在体内影响SlGA20ox4的表达。当OEZF3-pK7LIC和ProSlGA20ox4：：LUC共同渗透到烟叶中时，与用对照效应载体（pK7LIC）和ProSlGA20ox4∶：LUC共渗透的对照处理相比，荧光信号显著降低（图4b-4c）。这一结果表明，SlZF3可以通过与其启动子结合来抑制SlGA20ox4的转录。

此外，进行ChIP-qPCR以验证SlZF3和SlGA20ox4启动子的相互作用。事实证明，SlZF3-GFP融合蛋白可以与SlGA20ox4启动子的P5区（-1816bp至-1912bp）结合（图4d）。P5的qPCR信号是其他启动子区和对照（外显子和内含子区）的10倍以上。为了鉴定SlZF3结合的SlGA20ox4启动子P5区的潜在调控序列，作者进行了反向Y1H筛选。对6个阳性克隆进行了鉴定和测序。使用在线NEW PLACE工具预测了五种已知的顺式元件（ANAERO2CONSENSUS、ARR1AT、CAATBOX1、BOXLCOREDCPAL和DOFCOREZM），其中在两个阳性克隆中检测到CAATBOX1-元件。在ChIP-qPCR实验中，在P5序列中鉴定了DOFCOREZM元件（AAAG），表明SlZF3可以与该元件结合。为了证实这一点，进行了EMSA验证SlZF3是否能结合含有DOFCOREZM元件的探针（图4e）。研究表明，SlZF3蛋白确实可以与具有DOFCOREZM元件的探针结合，并引起迁移率偏移，而竞争探针削弱了偏移带的信号（图4e）。所有这些结果都证实了SlZF3可以通过直接启动子结合来调节SlGA20ox4。

最后，通过在SlZF3过表达系OE8中过表达SlGA20ox4来检测SlZF3和SlGA20ox4的遗传相互作用。研究发现，在OE8背景中过表达SlGA20ox4的植物显示出与野生型相同的株高（图4f-4h）。这进一步证实了SlGA20ox4是SlZF3的一个重要靶基因，其通过启动子结合被SlZF3抑制。

图4.SIZF3与SlGA20ox4启动子结合并抑制其表达 

   总   结  

SlZF3可以直接与GA生物合成基因（如SlGA20ox4）的启动子结合，抑制其转录，从而导致生物活性GA水平降低和植物矮化。同时，作者之前的工作表明，SlZF3通过与COP9信号体的亚基SlCSN5B相互作用，促进VTC1介导的抗坏血酸生物合成，从而提高ROS清除能力，从而增强植物对盐胁迫的耐受性。本研究鉴定并揭示了转录因子SlZF3具有调控番茄株高的生物学功能及调控机理，结合研究团队之前的发现，提出了SlZF3协调调控番茄生长发育与抗逆响应的工作模型（图5）。