项目文章 | Genome Biology （IF: 17.902）单细胞多组学助力于面包小麦根的不对称基因转录研究

题 目：Asymmetric gene expression and cell-type-specific regulatory networks in the root of bread wheat revealed by single-cell multiomics analysis

发表日期：2023年4月4日

发表期刊：Genome Biology

影响因子：17.902

实验方法：snRNA-seq，snATAC-seq，bulkRNA-seq、qPCR、RNA-ISH

2023年4月4日，著名学术期刊 Genome Biology 在线发表了华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室/湖北洪山实验室的鄢文豪教授团队题为“Asymmetric gene expression and cell-type-specific regulatory networks in the root of bread wheat revealed by single-cell multiomics analysis”的研究论文。研究报道了多倍体小麦根组织的单细胞分辨率转录景观和同源基因不对称转录，重建了细胞分化轨迹和细胞类型特异性基因调控网络。爱基百客为该研究提供单细胞（snRNA-seq和snATAC-seq）技术服务，总经理李泽卿作为共同作者参与该项研究。

同源基因的不对称表达在多倍体中普遍存在，这使得显性位点能控制特定亚基因组中的特定农艺性状。然而，目前对同源基因不对称表达的理解限于组织或器官层面，这些组织或器官由多种细胞类型组成，参考单细胞转录图谱的缺乏掩盖了细胞异质性引起的不对称表达的细节。最近，单细胞RNA测序(scRNA-seq)在植物中的应用提高了对各种植物物种中细胞异质性的理解，如拟南芥、水稻、玉米、棉花、花生和杨树。面包小麦是一种典型的异六倍体物种，与拟南芥和水稻相比，异源多倍体基因组和对其高地栖息地的适应可能有助于小麦中特殊的根组织和转录组异质性。

在该研究中，研究人员利用单核RNA测序(snRNA-seq)和单核转座酶可及染色质高通量测序分析(snATAC-seq)探索了小麦根组织在单细胞分辨率下的不对称基因表达模式。此外，作者构建了控制细胞身份的细胞类型特异性网络，并通过结合细胞类型特异性基因表达和染色质可及性，鉴定了驱动细胞命运从分生组织细胞向根毛转变的新的转录因子。

• 1、小麦根的单细胞转录组和调控图谱

研究表明，原生质体分离过程会产生影响基因表达的副作用，这可能会影响细胞聚类和细胞类型注释。为了消除原生质作用，snRNA-seq已被应用于植物单细胞组学。在该研究中，作者用小麦根建立了一个简单有效的单核RNA测序方案(图1a)。将小麦0.5cm根尖切碎进行细胞核分离，通过流式细胞分选(FACS)获得高质量细胞核，随后在10× Genomics平台上进行snRNA-seq和snATAC-seq。snRNA-seq数据获得6875个细胞，78763个基因被鉴定为表达基因，平均每个单核检测到4094个基因，与已发表的拟南芥单细胞数据集相当。对于snATAC-seq数据，大部分单个细胞的转录起始位点(TSS)富集得分大于5，TSS富集得分的中值为8.868；大多数细胞中的唯一核片段大于1000，中位数片段为11060。这都表明小麦根的snRNA-seq和snATAC-seq数据质量很高。

图1 小麦根尖的单核转录组图谱

• 2、小麦根细胞类型的鉴定

由于小麦中大多数基因是功能未知的，使用拟南芥序列和表达模式相似同源基因解释小麦单细胞数据。UMAP算法用于细胞聚类，图1b显示了带注释的细胞群，并依据根解剖示意图显示了其在根中的位置(图1c)。细胞群共分为22个，包括根中柱的原生韧皮部、原生木质部、后生木质部、筛分子、伴胞和中柱鞘；基本组织中的根毛、表皮/皮层和内皮层；根冠区中的小柱、根冠和根缘细胞。图1d显示了具有特定表达模式的前10个簇特异性标记基因。基于此，作者通过实时定量PCR(qPCR)和RNA原位杂交(RNA-ISH)分析验证了根边缘细胞(簇19)中的标记基因JAZ10、PDR8和PRN2，发现它们在根边缘细胞中的表达是整个根尖细胞的2-18倍(图2a–d)。DAR2同源基因是伴胞的标记基因，RNA原位杂交检测到其呈特异性和放射状的点状信号(图2e)。XCP1被鉴定为聚类13的标记基因。它在脉管系统中表现出非常相似的径向但空间上不同的表达模式，这是原生木质部的特征(图2f)。拟南芥WAT1的同源基因是原维管细胞的标记基因(簇5)，在位于延伸区起点的维管系统中特异性表达(图2g)。G-H2AX的小麦同源基因被鉴定为簇3的标记基因，主要在静止中心(QC)上方的近端分生组织和初级分生组织中表达(图2h)。这些结果表明了细胞类型注释的可靠性。此外，通过进一步对拟南芥、水稻和小麦中鉴定的根细胞簇进行成对比较(图2i–k)。发现在水稻和小麦中的内皮层、表皮(根毛和无根毛)、分生组织、韧皮部(韧皮部、伴胞和筛分子)和木质部簇的标记基因显示出相对高的相似性(图2j)。Sankey图显示了物种之间分生组织、韧皮部和木质部的重叠直系同源基因的百分比显著更高(图2k)。这些结果可能暗示了植物分生组织、韧皮部和木质部发育的保守调控网络。

图2簇特异性标记基因的验证以及水稻、拟南芥和小麦的根细胞簇的比较

3、小麦根表皮细胞和基本组织的分化轨迹

根毛对于植物获取和吸收养分至关重要。作者构建了表皮/皮层和根毛的拟时序发育轨迹。结果表明，皮层/表皮细胞是从相同的分生组织细胞簇(簇7)开始的。簇7首先分化为表皮/皮层I(簇0)；随后，簇0的一个子集分化为表皮-皮层II(簇12)。同时，簇0的另一个子集分化为根毛(簇6)(图3a)。为了更深入地了解表皮/皮层和内皮层的发育，作者利用簇2、3、7、0、12、10和17也构建了拟时序发育轨迹。负责内皮层身份的细胞簇(簇10和17)与簇3(近端分生组织)的相关性大于与簇7的相关性(图3b)。这与拟南芥中内皮层和皮层是由相同细胞分化而来的结论不同。此外，为了确定控制根毛、表皮/皮层和内皮层分化的调节因子，作者鉴定了在拟时序轨迹中显著富集的分支依赖性基因。发现RHD1、RHD2、RHD4、MRH2、MRH3、RHS19和RSL4的同源基因有助于根毛(簇6)的发育，而KAN1、ARF19、CRE1和MYB86同源基因在表皮/皮层II(簇12)命运决定中起作用(图3c-d)。在表皮/皮层和内皮层分化的轨迹中，DAG1、BRS1、MYB36、MYB59、LAC5、PBL15等的同源基因指导内皮细胞分化(图3d)。MYB36是SHR的下游靶标，调节拟南芥根内皮层凯氏带的形成。这再次支持MYB36对小麦内皮层发育的可能调节作用。

图3 根毛、表皮/皮层和内皮层的分化轨迹

4、单细胞分辨率下的亚基因组不对称基因转录

据报道，大约30%的小麦同源性三联体(在A、B和D基因组上有拷贝的基因)以不平衡的方式表达。在此研究中，作者利用snRNA-seq数据，分析获得了单细胞分辨率下的不对称基因转录谱，并将其与来自同一组织的bulkRNA-seq进行了比较。基于bulkRNA-seq数据，发现约60%的同源基因三联体显示出平衡性表达，但它们中的31.7%~76.1%在snRNA-seq鉴定的每个根细胞簇中表达不再平衡，尤其是在聚类21中，只有23.9%的基因以平衡的方式表达(图4a)。所有这些数据都有力地支持了不对称基因表达水平在整个发育过程中是高度异质的。此外，簇18-21中具有不平衡表达模式的同源基因的百分比高于簇0-17(图4b)，表明与干细胞龛、小柱、根边缘细胞和伴胞相比，来自A、B和D亚基因组的同源基因对维管系统、基本组织和分生组织的发育更有贡献。对基因沿着细胞分化轨迹的不对称表达进行分析，发现原生韧皮部和原生木质部的伪祖先细胞(簇3)仅拥有46.5%的不平衡表达基因，但对于原生韧皮部和原生木质部，这一数字分别增加到52和53.4%(图4c)。与伴胞和未成熟筛分子细胞情况相似，具有不对称表达模式的基因比例从46.5%分别增加到79.6%和51.3%(图4d)。这些结果表明，亚基因组间不对称的基因表达可能是细胞分化的潜在驱动力。

图4 细胞类型依赖性不对称基因表达

5、小麦根毛分化的细胞类型特异性调控网络和关键调控因子

为了探索细胞类型特异性调控网络，作者在全基因组范围内关联基因转录与动态可及染色质区域(ACRs)。首先，根据snATAC-seq鉴定的染色质开放性对细胞进行聚类，并将其与snRNA-seq关联(图5a-b)，共获得10个注释和相关性都很好的簇。在每个细胞类群中，snRNA-seq和snATAC-seq数据之间都显示出高相关性(图5c)。接着，作者利用SCENIC4来鉴定基于共表达和基序富集的以TF为中心的调节子。总的来说，在22种根细胞类型中鉴定出了185个TF调节子，代表性的包括ERF043、PLT1、MYB3R4和BHLH130，显示出高度的细胞类型特异性。图5d显示了每个细胞群的前5个代表性TF。其中，SPL9同源基因TaSPL14被鉴定为几种维管系统细胞类型中的关键调节子，包括原生木质部(簇13)、原生韧皮部(簇16)和伴胞(簇21)(图5d)。为了验证SPLs在根维管系统中的特异性调节功能，作者利用CRISPR/Cas9产生的两个taspl14敲除系。与野生型相比，taspl14敲除系的根在根横切中显示出伴侣细胞数量减少和原木质部孔增加(图5e-f)。此外，TaSPL14的预测靶基因BAM1和LOB同源基因，在taspl14敲除系的根中的表达下调(图5g)。位于BAM1同源基因上游的染色质仅在原生木质部、后生木质部和分生组织中特异性可及，并且TaSPL14的结合基序在该区域富集。有趣的是，通过已发表的DAP-seq数据还检测到TaSPL14与该区域的结合(图5h)。因此，作者认为TaSPL14-BAM1模块在小麦根的维管系统发育中起着重要作用。

接下来，作者以根毛发育为例，阐述了如何鉴定在细胞分化过程中控制细胞命运变化的调节因子。根毛细胞起源于特定的分生组织细胞群(簇7)，然后分化为表皮/皮层I，用于根毛起始(图5i)。首先，作者鉴定了沿拟时序轨迹的差异表达基因，并再次利用SCENIC4鉴定的调节关系和ATAC-seq揭示的TF印记。通过这种方法，作者鉴定出MYB3R4、REF6、GRAS和MYB3R5的同源基因是促进分生组织细胞向表皮/皮层I分化的主要TFs，而HDG1、GATAs、ERF060和CAMTA3是负责表皮/皮层I向根毛分化的TFs(图5j)。HDG1与GL2、ANL2、FWA、ATML1、PDF2和HDG1属于相同的IV类同源结构域-亮氨酸拉链基因家族，这些基因家族已被证明与表皮细胞分化有关。拟南芥GL2是根毛发育的负调节因子。这些结果表明，细胞类型特异性网络和关键调控因子被鉴定出了，相应基因可以成为理解根发育和根性状的重要靶标。

图5 细胞类型特异性调控网络和根毛分化的关键调控因子

在这项研究中，作者构建了小麦根的单细胞图谱。在单细胞分辨率下研究了不对称转录，发现小麦根同源基因的不对称模式是细胞类型依赖性的。此外，细胞分化轨迹表明，表皮/皮层和内皮层起源于小麦根的不同分生组织，这与拟南芥的情况不同，但与玉米和水稻的情况相似。作者还将高可变基因的活性ACRs与根毛发育的拟时间轨迹相结合，构建了轨迹特异性调控网络。这个轨迹网络突出了上游转录因子(TF)在根毛分化中的调节。总之，研究描述了小麦根的组织，特别强调了多倍体物种单细胞分辨率中基因表达的不对称异质性，这可能有助于多倍体物种对根性状的精确育种。

链接：DOI: 10.1186/s13059-023-02908-x