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原核生物同样要你好看

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原核生物同样要你好看


  • 原核生物同样要你好看

都说原核生物ChIP不好做,一方面原核生物并没有真正意义的染色体结构,因此对于ChIP而言,很难保证染色质(其实是蛋白和DNA复合物)的质量,另外ChIP体系对于原核生物也需要调整,但是不同原核生物调整策略也不尽相同,所以对于原核生物而言,需要一个对ChIP有着丰富经验的实验老手才能拿到一个好的ChIP结果。


        武汉爱基百客作为一家专业提供表观遗传学技术服务的公司,ChIP一直是我们强项所在。原核生物的ChIP,也是经验丰富。近期在铜绿假单胞菌研究中,南开大学医药化学生物学国家重点实验室吴卫辉课题组在Nucleic Acids Res(IF=11.147)中发文PvrA Is a Novel Regulator That Contributes to Pseudomonas Aeruginosa Pathogenesis by Controlling Bacterial Utilization of Long Chain Fatty Acids探究PvrA在细菌侵染过程中的相关机制。

微生物ChIP 

其中关于PvrA的ChIP-seq实验与分析,由爱基百客提供技术服务。一起来看一下作者是如何开展相关研究的。

 

1、研究背景

铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛,为土壤中存在的最常见的细菌之一,同时它是一种致病菌,可以引发人类急性感染。对于致病性细菌而言,获得和有效利用宿主营养物质至关重要。在这个过程中,细菌的调控蛋白在其中发挥了重要作用。探究铜绿假单胞菌中调控蛋白挖掘与机制解析具有重要的作用。

2、实验设计

微生物ChIP

3、实验结果

3.1 感染过程中铜绿假单胞菌转录组分析

   作者利用感染6小时候小鼠收集细菌细胞进行转录组测序,并与空白对照进行了比较,发现19个基因显著上调差异表达, 并且经过了RT-PCR验证。其中前人已经报道的、在细胞毒性中发挥重要作用的关键基因exsA, pchR, typA 和 fis也存在于本次的19个DEGs中。为了研究这种差异表达模式的保守性,作者利用其他菌株进行同样的实验,结果与之一致。

3.2 差异表达基因在致病作用验证

为了进一步说明19个差异表达基因的作用,作者利用突变体菌株库以及自己构建突变体菌株的方式,获得了19个基因的突变体菌株。利用突变体菌株进行侵染实验,结果发现,PA295突变体的细菌定植能力大幅下降,另外提高了小鼠的存活率。并且这种改变可以由回补PA2957恢复。作者将该基因命名为pvrA,并且对其序列研究,发现其在假单胞杆菌中具有保守性,属于TetR家族转录调控因子。

微生物ChIP

3.3 pvrA结合位点确定

为了探究pvrA结合特性,作者构建了Flag标签转基因材料,利用ChIP-seq(武汉爱基百客提供了该项技术服务)手段,发现其结合了宿主卵磷脂利用关键基因plcH、fadD1、fadD6和PA0508以及glcB、maeB和aprA等一些三羧酸循环和细菌毒性相关基因。并利用EMSA证实了这些基因启动子区域的结合(Fig2)。利用ChIP-seq数据,MEME对其motif分析,发现其保守性结合于5′-CGGTCA-3′序列(Fig3 A),将fadD1启动子序列删除该序列后,EMSA结果显示其结合能力也丧失(Fig3 B),进一步证明其结合序列的保守性。

为了进一步说明pvrA的调控作用,作者构建了pvrA的突变体菌株,利用野生型和突变体菌株感染小鼠后收集菌株进行基因表达量分析,pvrA, plcH, fadD1, fadD6, PA0508, aprA, glcB 和maeB基因在野生型中都上调,而在突变体中表达抑制,证实了pvrA对该基因的调控作用(Figure4)。

微生物ChIP

3.4pvrA在细菌利用卵磷脂以及棕榈酸发挥了重要作用

因为pvrA结合基因参与了卵磷脂和棕榈酸的利用,为了证实pvrA的作用,作者利用野生型和突变体菌株分别在葡萄糖培养基、卵磷脂唯一碳源培养基、棕榈酸唯一碳源培养基上进行培养,并对其中关注基因进行了表达量分析。发现突变体菌株在卵磷脂唯一碳源培养基、棕榈酸唯一碳源培养基上生长都受到抑制,并且重要基因的表达都受到了抑制。总的来说,作者通过突变体材料验证了结合靶基因调控基因表达的机制。

3.5棕榈酰辅酶A是PvrA的配体

根据前人的报告,脂肪酰辅酶A作为配体在脂肪酸利用过程中发挥了重要作用,作者猜测榈酰辅酶A可能作为PvrA的配体发挥作用。作者利用分子对接分析(Molecular docking,研究配体-蛋白组对接的分析手段)预测两者可能存在相互作用,并且R136可能是互作关键位点。利用ITC分析(等温滴定量热法,以热力学探究分子互作),显示PvrA和棕榈酰辅酶A之间存在积极的相互作用,但与棕榈酸之间没有相互作用(Figure 7)。用丙氨酸替换R136(R136 A突变)降低了PvrA和棕榈酰辅酶A之间的相互作用。利用增加棕榈酰辅酶A后EMSA实验,说明棕榈酰辅酶A增加了pvrA的结合DNA能力,这种增加会因为R136A突变而丧失(Figure 8)。SPR分析(表面等离子体共振)pvrA与fadD1启动子结合,结果与EMSA一致(Figure 9)。此外,利用R136A回补ΔpvrA突变体,发现其既不能恢复fadD1、fadD6、PA0508和plcH表达,也不能恢复细菌毒性(Figure10)。这些结果表明,棕榈酰辅酶A可能是PvrA的配体,激活plcH和脂肪酸利用基因。

微生物ChIP

3.6 PvrA可能通过协同调节多基因参与细菌毒性

为了验证plcHfadD1fadD6 和 PA0508在细菌毒性中的作用,作者构建了野生型以及各个基因的单突菌株、双突菌株、三突以及四突菌株,结果表明单突、双突、三突菌株的菌落总数与野生型并无差异,四突明显降低,预示着PvrA可能通过协同调节多基因参与细菌毒性。

微生物ChIP

 

文章总结:

文章整体思路清晰,从转录组入手,鉴定显著性差异表达的基因,并对这些基因的功能进一步验证。对于差异表达的调控因子PvrA重点关注,首先通过ChIP-seq探究结合位点以及保守结合序列,并通过突变PvrA后靶基因的表达差异证明结合作用的真实性,随后对于下游靶基因进行突变等试验证明靶基因的功能。并且对于目的蛋白发挥作用的互作配体棕榈酰辅酶A也进行了探究,通过分子对接分析、ITC分析、EMSA证明了棕榈酰辅酶A在PvrA发挥功能时的重要作用。最后通过设计不同突变体材料,进一步解析了PvrA协同调控多基因影响细菌毒性的机制。

文章亮点颇多,首先材料的丰富性也是让人羡慕不已,突变体材料对于验证基因功能是十分有力的武器,作者对19个上调基因全部获得突变体材料,靶基因的突变体材料,并且后期构建的单突、双突、三突、四突材料等更有说服力的证明了基因的功能和调控机制。另外对于目的调控蛋白的研究也是十分完整,对其结合序列、互作蛋白都有相应研究,值得借鉴。通过ChIP-seq鉴定靶基因和保守结合序列,随后EMSA验证结合,并通过靶基因的突变体材料和目的蛋白突变体材料,证明调控作用的真实性。对于蛋白发挥功能的互作蛋白研究也是我们一直推荐要做的研究,作者也对此进行了探究,并且对配体结合作用以及具体发挥功能的关键核心蛋白功能域做了探究。最后通过前面的结果,构建了目的蛋白的调控网络,文章思路流畅且清晰,结果多重验证保证了结果的真实性,该研究思路适用于研究对目的蛋白调控机制的研究。


IP类产品:ChIP-seq,DAP-seq,CLIP-seqRIP-seq,DRIP-seq,6mA-IPseq,MeRIP-seq,IP,Co-IP

测序产品:WGBSATAC-seq,WGS,RAD/GBS,smallRNA,LncRNA,转录组,精准转录组,全转录组,降解组

分子产品:EMSA,Y1H,Y2H,分子标记,荧光定量,载体构建

新星产品:ScWGBS,ScATAC,ScRNA-seq,CUT&RUN,CUT&Tag

其他产品:代谢组,修饰酶组


关键词:ChIP,转录因子,爱基百客

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