【一区4.611分】褐飞虱-爱基百客ChIP-seq又发文章

真核生物转录起始过程十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程，从而完成对下游基因的调控作用，那这种调控机制如何去探究的呢？近日Science China-Life Sciences发文FoxO directly regulates the expression of TOR/S6K and vitellogenin to modulate the fecundity of the brown planthopper，阐述了FoxO通过与NlS6K，NlTOR启动子和NlVg外显子结合影响Vg网络中的基因表达来调节昆虫繁殖力，其中FoxO的ChIP-seq实验由爱基百客承担。

作为保守的转录因子，FoxO在抗逆，寿命，生长和繁殖多种生理过程中起着至关重要的作用。人们之前关于FoxO的研究主要集中在人类，小鼠，果蝇和秀丽隐杆线虫上，而关于农业害虫的报道很少，特别是关于FoxO如何调节昆虫繁殖力知之甚少。在亚洲，褐飞虱（BPH）是水稻生产中最严重的害虫之一，高繁殖力是褐飞虱爆发的主要原因。

（1）ChIP-seq鉴定NlFoxO结合位点

为了深入了解NlFoxO如何调节BPH中的繁殖力，作者利用BPH成年和若虫进行了ChIP-seq，并鉴定了11069个NlFoxO结合的特异peak，这些peak关联到BPH转录组中的2760个基因。基于转录组和BPH参考基因组之间的注释文件，将距5'末端上游转录起始位点3 kb的序列定义为启动子序列。这些结合区域中，基因间区占61.06％，启动子占6.80％，内含子占22.56％，基因的CDS占9.18％。在5'或3' UTR检测到不到0.50％的结合位点。然后作者使用MEME软件发现四个相似的motif都包含TGTTT core序列。已知FoxO调控的靶基因在不同物种之间差异很大，因此作者比较了BPH，黑腹果蝇和尖音库蚊的靶基因。结果显示有18.06％的基因（317）在BPH和果蝇中都是共有的，而在BPH和尖音库蚊之间没有发现重叠的基因。果蝇和尖音库蚊之间只有3个保守FoxO靶基因。                                         

图1 FoxO ChIP-seq结果

（2）NlFoxO直接与S6K，TOR和Vg结合并影响其表达

作者为了验证N1FoxO是否特异性结合候选靶基因区域，使用ChIP定量PCR（ChIP-qPCR）进行验证。ChIP-qPCR结果证实了N1FoxO特异性结合核糖体蛋白S6激酶（S6K），丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR（TOR），卵黄蛋白原（Vg）这些基因启动子区域。经过进一步分析发现N1FoxO可能与NlS6K和NlTOR的启动子以及NlVg的第三个外显子结合，另外，作者进行了qRT-PCR来验证NlFoxO对成年雌性这些基因表达的影响。与对照组相比，NlS6K的mRNA水平在72 h内下调，NlTOR的mRNA水平在24 h和48 h下调。相反，NlVg的mRNA水平在所有三个时间点均显着增加。这些结果表明，N1FoxO的结合可能促进N1S6K和N1TOR的表达，并抑制N1Vg的表达。进一步作者利用萤光素酶活性来检测启动子活性。结果表明NlFoxO直接结合增强S6K和TOR的启动子活性。

图2 FoxO ChIP-qpcr验证

（3）RNAi探究NlFoxO对BPH生殖力的影响

作者以短翅类BPH作为材料，将dsFoxO注射到一天大的BPH短翅类成年雌性，结果发现NlFoxO的mRNA和蛋白水平显着降低。然后作者进一步评估NlfoxO对BPH繁殖力的影响。结果显示NlVgR的mRNA水平在72小时内显着下降。尽管NlVg  mRNA水平在72小时内上调，但注射dsFoxO后72 h N1Vg的蛋白质水平却显着降低。最后，作者在注射dsFoxO后去测量BPH雌性所产卵的数量。与对照（dsGFP）相比，每对产卵的平均数量从628.70显着下降到305.50，下降了51.40％（图4E），平均孵化率从82.54％显着下降到75.33％。这些结果证实了N1FoxO对于维持BPH中的正常繁殖是必不可少的。

图3 qRT-PCR验证NlFoxO对BPH生殖力的影响

总的来说，本研究表明FoxO通过与NlS6K，NlTOR启动子和NlVg外显子结合影响Vg网络中的基因表达从而调节昆虫繁殖力。