植物单细胞研究方法分享之拟南芥侧根发育及分化

植物单细胞研究目前还在初期阶段，虽然已经有一些文章有报道，但是大多还只是拟南芥、水稻或者玉米这样的模式生物上，研究内容及方法也没有特别多，如何能将模式物种的单细胞研究方法有效“移植”到非模式生物上，并且能够的用于应用研究也是植物单细胞的Z终发展趋势，笔者会尽量多总结，多分享其他植物单细胞研究者的科研思路。

今天我们要分享的是拟南芥侧根的发育及分化过程，作者从单细胞转录组的手段入手，提出了拟南芥侧根发育分化轨迹及侧根形成模型。

Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNA sequencing reveals order of tissue initiation

胚后器官发生对植物发育至关重要。地下侧根(LRs)形成了大部分的成熟根系，但LRP原基(LRP)的个体发生尚不清楚。在本研究中，作者对拟南芥LR形成的前四个阶段进行了单细胞RNA测序。分析得出了一个模型，在该模型中，一组具有不同于中柱鞘起源的细胞身份的前体细胞快速重组并分裂成混合基质组织/干细胞生态位命运和血管前体细胞命运。底层组织和干细胞的生态位很快分离，一部分更特化的维管细胞形成蔗糖运输韧皮部细胞，似乎连接到初生根。作者没有发现类似表皮或根冠的细胞，这表明外层组织可能形成较晚，在LR出现之前。在这个阶段，一些剩余的原始细胞形成了原基侧翼，而其余的形成了一个多能细胞库，如果LR受损，这些多能细胞能够取代LR。激光消融中心和外侧LRP区域显示，剩余的细胞重新启动组织开始形成LR的序列。总的来说，作者的研究揭示了LR形成的本体论层次，主要根组织和干细胞的早期和顺序分化。

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根原生质体制备后，用流式细胞仪分选细胞，Z终获得573个细胞，覆盖了LRP的I期到IV期的细胞类型。

本文的实验安排不算很复杂，但是文章通过单细胞转录组数据获得LRP的I期到IV期的所有细胞类型的转录本，同时鉴定了不同时期中的细胞类型的分群情况，由marker基因表达定位实验确认了分群后的细胞类型，而拟时序分析推测了LRP分化时细胞类群分化情况，结合marker基因表达定位实验，确认了LRP分化发育的分化特征。

1、细胞分群注释结果

图：对获得的单细胞转录组结果进行无监督模式分群，Z终分为7个细胞群，不同的细胞群参与不同的细胞功能

图：通过将不同的细胞群的转录本数据与已报道的侧根的转录组数据进行对比，以及marker基因表达实验结合进行分群注释，将得到的7个细胞类群注释到了对应的细胞。

2、LRP胚后发育模型推测

图：根据拟时序分析及对应的marker基因不同时间的表达情况结合，推测出了LRP的胚后发育轨迹模型。

该篇研究已经确定了在LR器官发生的早期阶段形成的7个细胞群（7个细胞群分别是Protophloem-like cell、Endodermis/QC transitioning cell、Vascular-like 1 cell、Vascular-like 2 cell、Primordial cell、Flanking cell以及QC transitioning cell）。其中五个构成了完全新的细胞类型，而QC-transition细胞代表LR QC的前体状态，而原始细胞可能对应于I阶段的创建细胞子细胞。作者还确定了其中6个细胞群在LRP中的空间定位和它们形成的时间顺序，这是分级和保守的——在这个模型中，群体在层中的空间组织将由前驱群体的位置决定。内层的维管细胞和外层的内皮层细胞/QC过渡态干细胞在II期和III期由原基细胞分化而来，两侧未分裂或缓慢分裂的细胞仍将是原基细胞，而其中一些细胞将在第四阶段分化为侧翼细胞，Z终建立LRP的生长边界。中心区域的一些内皮层/QC过渡态干细胞会在第四阶段形成QC-过渡态细胞，随后生成QC，可能还有其他的SCN细胞。其余的内皮层/ QC过渡态干细胞将建立基础组织谱系。

在维管发育分支上，维管类细胞1在III期形成维管类细胞2，在IV期时，这些细胞有一些将分化成原生韧皮部类细胞，原韧皮部的细胞可能是与初生根韧皮部组织相邻的细胞，这预示着维管系统的连接，并表明来自初生根组织的信号可能会诱导它们的特化。

本文中，作者没有发现任何与表皮或侧根冠细胞有亲和力的细胞群，表明这些细胞可能是在发育后期形成的，根据它们的定位或其他未确定的细胞推测可能从QC过渡细胞分化而来。