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客户文章 | ChIP-seq 助力杆状病毒多角体蛋白超表达机制的揭露

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发表单位:浙江大学

发表时间:2022年1月14日

期       刊:Viruses(IF:5.048)


2022年1月14日,浙江大学动物科学学院的吴小峰教授团队在期刊Viruses(IF:5.048)发表题为“Actin Contributes to the Hyperexpression of Baculovirus Polyhedrin (polh) and p10 as a Component of Transcription Initiation Complex (TIC)”的研究论文。该研究对杆状病毒的晚期基因polhp10的超表达机制进行了探索,发现肌动蛋白作为转录起始复合物的组成部分正调控晚期基因的高表达。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持



研究背景


杆状病毒是一种包膜的双链DNA病毒,主要感染鳞翅目昆虫。它们被广泛用作环境友好型杀虫剂,近来被开发用于哺乳动物基因传递。杆状病毒生命周期里有一个令人惊奇的现象——两个极晚期基因polh p10 的高表达,这导致了杆状病毒的包涵体生成。但这两个基因不是病毒复制所必需的,可以删除或者被外源基因替换。基于这一原理,杆状病毒被用来开发基因表达载体。


家蚕杆状病毒系统(BEVS)是目前最重要的表达系统之一,商业开发用于疫苗的生产。然而,外源蛋白的表达通常低于这两个基因的表达因此,深入阐明这两个极晚期基因的高表达机制具有重要的意义

研究思路

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       该研究首先利用DNA Pull-down和液相色谱质谱联用技术筛选基因启动子结合蛋白,随后借助RT-PCR、CoIP、共定位、ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq等技术验证了肌动蛋白与基因转录起始的关系。


研究结果


1. 筛选polhp10的启动子结合蛋白


利用DNA Pull-Down和液相色谱质谱联用技术筛选polhp10的启动子结合蛋白,并对两个基因的宿主蛋白进行比较分析。许多新的宿主蛋白被发现,包括肌动蛋白和核糖体生物发生调节蛋白的几种异构体。大多数宿主蛋白与RNA加工和基因转录有关

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质谱分析polhp10启动子的结合蛋白

2. 肌动蛋白动态对polhp10的转录至关重要


为了确定肌动蛋白是否影响polhp10的转录,利用药物抑制G-actin组装或者稳定F-actin。RT-PCR结果表明polhp10的转录确实被延迟了。

RT-PCR分析在细胞松弛素D和Jasplakinolide作用下对polhp10的转录影响

3. 肌动蛋白与病毒聚合酶有关联且共定位


作者做了一系列的Co-IP实验去检测肌动蛋白和病毒聚合酶的潜在关联。结果表明肌动蛋白与病毒的3个亚基互作,这三个亚基参与编码病毒RNA聚合酶元件。另外,共聚焦显微镜分析显示肌动蛋白和病毒聚合酶存在细胞共定位,进一步确定他们的互作关系。核肌动蛋白动态地调控RNA聚合酶II的定位。

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肌动蛋白与病毒聚合酶的关系分析

4. 肌动蛋白是polhp10转录起始复合物的组成部分


通过ChIP-seq分析,在病毒基因组中鉴定得到54个肌动蛋白结合位点。基因组注释结果显示,70.95%的肌动蛋白位点位于注释基因的启动子区域,这意味着肌动蛋白参与病毒基因的早期转录。病毒晚期和极晚期基因的转录始于保守的晚期和极晚期基因启动子motif序列(A/T/G) TAAG。TAAG序列是polhp10启动子的必要元素,也是病毒聚合酶的常见结合motif。通过de novo motif分析,肌动蛋白位点大部分显著富集的motif包含一个主要的共有序列“TATAGAAG”,这在一定程度上证实了肌动蛋白参与病毒聚合酶的转录。


ChIP-seq的结果由ChIP-qPCR分析进一步证实,结果显示肌动蛋白显著富集在polhp10启动子区域以及邻近TSS的p10编码区域。


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5. 肌动蛋白与转录调控因子互作,并可能束缚转录起始复合物的形成


同样利用Co-IP实验和共定位分析证实肌动蛋白能够与调节子PK1、IE1和VLF-1互作和共定位。


6. 肌动蛋白超表达刺激polh和p10启动子的转录


    超表达肌动蛋白后,作者发现肌动蛋白促进polhp10启动子的转录。

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超表达肌动蛋白刺激polhp10的转录

7. 杆状病毒可能劫持宿主转录器的肌动蛋白


在杆状病毒感染的后期,宿主基因的表达被关闭。为了确定肌动蛋白过表达是否导致宿主基因转录变化,作者进行了RNA-seq分析。结果表明肌动蛋白对宿主基因有正向和负向作用,其筛选到82个上调基因和39个下调基因。作者通过ChIP-seq数据鉴定到5813个带肌动蛋白结合位点的宿主基因,其中4.69%位于启动子区域。


将RNA-seq和ChIP-seq数据结合,上下调基因和肌动蛋白结合基因重叠分析。对这些基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示差异表达基因主要富集于转录负调控、DNA-模板合成、RNA聚合酶II转录的生物学过程。此外,这些基因呈现出强的DNA结合转录因子活性、肌动蛋白结合、DNA结合和序列-特异DNA结合相关的分子功能。这些结果暗示杆状病毒可能劫持宿主转录器的肌动蛋白来辅助其基因表达



结语:


在这项研究中作者发现肌动蛋白在杆状病毒极晚期基因的高表达中扮演重要角色,肌动蛋白与病毒聚合酶转录起始复合物TIC的组成元件相互作用促使肌动蛋白能够作为支架分子促进TIC的形成。ChIP-seq技术为本次研究提供了强有力的支持。


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