客户文章 | Nature Communication鸡卵泡发育过程中颗粒细胞的转录组动态和染色质结构

发表单位：四川农业大学

发表日期：2022年1月22日

期  刊：Nature Communications（IF:14.919）

前言

       2022年1月22日四川农业大学李地艳教授团队和李明洲教授团队联合在Nature Communications（IF:14.919）期刊发表了题为“Dynamic transcriptome and chromatin architecture in granulosa cells during chicken folliculogenesis”的研究论文。该研究探讨了鸡卵泡发育过程中10个时期里颗粒细胞的转录组动态，并评估了染色质结构动态及其在3个关键时期如何影响颗粒细胞中的基因表达。爱基百客为该研究提供了ChIP-seq技术支持。

研究背景

   卵泡发育是一个极为复杂的过程，卵泡发育异常会影响正常排卵，也会导致卵子的质量问题。卵泡由中央的卵母细胞和周围的内分泌细胞(内层由颗粒细胞(GCs)组成，外层由鞘细胞组成)组成。在鸟类中，研究员们对卵泡发育过程中颗粒细胞的形态和转录调控的发育变化进行了大量研究，主要关注原始卵泡的激活或优势卵泡的选择。三维染色质结构是一个重要的转录调控因子，然而关于鸡卵泡发育过程中颗粒细胞转录调控的动态和作用知之甚少。

研究思路

研究结果

1. 鸡卵泡发育过程中颗粒细胞的动态转录组。

作者首先对鸡卵泡10个发育时期（SWF、LWF、SYF、LYF、F5、F4、F3、F2、F1、POF）的组织进行了RNA-seq实验，随后分析了差异表达基因。结果表明在卵泡发育过程中具有发育阶段依赖性的基因动态表达与功能分化有关。为了准确描绘颗粒细胞的转录组变化，作者还对三个时期（SWF、F1和POF）的颗粒细胞进行scRNA-seq实验，鉴定得到了一个在这三个时期呈现表达变化的特征基因子集。

鸡卵泡发育过程中10个时间点

卵泡发育过程中颗粒细胞(GCs)的转录组学特征

2. 颗粒细胞染色质区的发育变化和局部可及性

为了阐明染色质结构多维度的变化，以及它在卵泡发育过程中是如何影响颗粒细胞的基因表达，作者采用了原位Hi-C技术去绘制跨越SWF、F1和POF三个时期的染色质接触图谱。随后，计算了多元冯·诺依曼（VNE）熵去测量卵泡发育过程中3D结构变化。结果表明POF时期VNE值高于SWF和F1时期，推测可能是在POF时期染色质结构更无序和松弛，F1时期成熟的颗粒细胞染色质结构更稳定和有序。

颗粒细胞发育过程中染色质结构的动态变化

   作者在颗粒细胞的三个时期发现了大量的区室转换。大部分转换（63.53%）是单向的，从A到B（”AAB”和“ABB”，130.8Mb）或者从B到A（“BAA”和“BBA”，94.42Mb），其余的是瞬时转换，要么是“ABA”，要么是“BAB”（129.28Mb）。虽然作者观察到卵泡发生过程中有动态的区室化，这伴随着基因表达的轻微变化，但只有在SWF和POF时期观察到基因表达发生区室转换的显著差异。

卵泡发育过程中鸡颗粒细胞的区室动态

        为了测量局部可及性的差异，作者还进行了ATAC-seq实验。结果发现相比较于B染色质区，A染色质区富集更多的ATAC-seq信号。在SWF和F1时期观察到时期特异的peak，它们富集那些与GATA转录因子家族有关的motif，暗示这类转录因子在这2个时期的重要性。此外，POF特异的peak主要富集那些涉及细胞毒性和凋亡转录因子（包括KLF5、PITX1和OTX1）的motif。

卵泡发育过程中鸡颗粒细胞的染色质可及性

3. 颗粒细胞的大部分TADs在卵泡发育过程中高度稳定

为了调查不同细胞的TAD保守性，作者下载了鸡的成纤维细胞和红细胞的Hi-C数据，并做了比较分析。作者发现在卵泡发育过程中颗粒细胞的98.3%TAD边界是不变的。作者还发现在A区室富集的TAD在尺寸上小于主要富集于B区室的TADs。推测这可能是因为在基因密集区局部结构能够容纳更活跃的基因调控。

作者在F1时期观察到了一个比SWF和POF时期更强的TAD绝缘边界，暗示当卵泡成熟时局部染色质的空间分离增加。此外，作者还分析了动态边界的基因表达。这些结果表明颗粒细胞中鉴定的大部分TADs在卵泡发育过程中是稳定的。

卵泡发育过程中鸡颗粒细胞的TAD边界是基本稳定的

4. 卵泡发育过程中转录变化伴随着TAD内部互作的波动

为了评估卵泡发育过程中TAD内部互作的动力学，作者评估了1831个cTADs（consensus TADs），计算了每个样品cTADs的结构域分值（D-score）。和以往报道的结果一致，分值越高的cTADs表现出易于接近和更高的基因表达水平。此外，功能富集分析暗示结构域分值的变化伴随着典型的颗粒细胞生物学功能。这些结果暗示鸡卵泡发育过程是伴随着TAD内部变化的。

卵泡发育过程中鸡颗粒细胞启动子-增强子互作关系的重连接

5. 卵泡发育过程中加强了颗粒细胞功能分化的靶基因启动子的全局重组

  为了研究大量的靶基因启动子（PEIs）重组是如何影响卵泡发育过程中颗粒细胞的转录组差异，作者利用一个调控潜力分值（RPS）去测量多个增强子对特定基因的调控作用。正如作者预期的，RPS值高的基因拥有更高的表达水平，这一点证实了增强子的叠加效应能够增加基因的表达。

  为了进一步探索增强子在转录调控中的作用，作者在三个时期使用了H3K27ac抗体进行ChIP-seq分析。通过分析H2K27ac的分布来测量可能参与PEIs的增强子活性。结果显示约20.04%的PEI相关基因与超级增强子（SEs，具有广泛的H3K27ac信号）有关，表现出更高的RPS和和表达水平。

  作者随后鉴定分析了6个典型发育模式的2659个基因，它们在不同时期呈现差异RPS分值（|log₂FC|>1.5和|△|>3）且伴随着增强子活性的改变。研究结果还证明候选位点在未来的研究中可以被分析。CTCF位点优先定位于启动子和/或增强子附近来约束PEIs。

卵泡发育过程中颗粒细胞的启动子-增强子互相作用（PEIs）的重构

总结

 该研究的作者利用了RNA-seq、scRNA-seq、Hi-C、ATAC-seq和ChIP-seq等技术对鸡卵泡发育过程中与生理功能相关的颗粒细胞中的染色质结构和转录组特征进行了综合分析。总之，该研究的结果暗示卵泡发育过程中颗粒细胞的转录组和染色质结构变化会推动伴随的转录活动，同时也为颗粒细胞的深度功能描述提供了有价值的资源。