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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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干货! DNA提取详解,一文get裂解、纯化和检测的方法

70年前赫尔希A.Hershey和蔡斯M.Chase的大肠杆菌噬菌体实验证明DNA是遗传信息的载体,自此奠定了DNA在分子生物学研究的地位。目前,核酸提取已经成为开展分子生物学研究的基础,而核酸提取的质量成为开展下一步实验的决定因素。很多同学刚进入实验室接到的任务除了洗瓶子、跑PCR就是提DNA吧。小编今天和大家探讨下DNA提取的技术原理,以期帮大家将理论与实践结合起来。


DNA提取基本原则


DNA质量是进行下一步实验的关键,DNA提取有两个基本原则:保证DNA结构的完整性和纯度。


l DNA结构的完整性。分子生物学大部分研究是为了获取序列信息,研究生物学功能。完整的序列才能获得精确的功能。不同下游实验对DNA序列的完整性要求不同,其中二代测序为获取全基因组序列信息,对DNA的完整性要求较高。


l DNA的纯度。尽量排除其他大分子物质对DNA的干扰,以免影响后续实验。



DNA提取两步走


DNA提取是将DNA从组织中分离出来的一项重要技术。别看有些DNA提取实验步骤繁杂,本质上只有两步:裂解和纯化。裂解是将样品细胞结构破坏,使DNA和其他细胞成分游离在溶液中。纯化将DNA与其他的细胞成分(比如蛋白、脂质、多糖和RNA等)分离。


基因组DNA裂解的方法有机械作用、化学作用和酶作用。


机械作用常见的有液氮研磨。


化学方法有CTAB和SDS法。CTAB是阳离子去污剂,SDS是阴离子去污剂。它们都可以溶解细胞膜,达到裂解的目的。去污剂使蛋白质变性,对膜结构进行破坏,把与核酸相连接的蛋白质解开。


酶的作用,比如蛋白酶K的消化作用。


纯化方法大比拼


裂解完细胞结构,将DNA分离的基本思路就是利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理、化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。比如:


1. DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。用高浓度的盐溶液溶解DNA,能去除在高盐中不能溶解的杂质;用低浓度的盐溶液使DNA析出,能除去溶解于低盐溶液的杂质。


2. 大部分蛋白质不能忍受60-80度高温,而DNA在80度以上才会变性。


3. DNA不能溶于酒精,但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精。



沉淀法


沉淀法是经典实验方法,主要的步骤是通过酚/氯仿抽提去除蛋白质,然后使用乙醇/异丙醇沉淀DNA。酚可以从水相中抽提变性的蛋白质,抑制DNAase的降解。氯仿则加速有机相和水相分层,去除残余酚。


优点:成本低、大样本量处理、产量高;


缺点:酚/氯仿是有毒试剂,需要在通风橱操作,对实验人员健康有威胁;酚/氯仿去除蛋白,如果裂解溶液中蛋白超过了饱和度,可能会有残留的蛋白质,可以多次反复抽提,但可能损失DNA;另外此方法较为耗时。


离心柱法


商业化方法,主要的原理是利用离心柱上的吸附膜,可以特异吸附DNA。纯化主要是利用低盐、高盐溶液达到结合和洗脱DNA的目的。


优点:人为操作影响较小,相比较于酚氯仿法纯度高;安全、快速。


缺点:产量低,且对样本量有限制。大规模检测时,对人员和仪器的需求较多。


磁珠法


磁珠法是将纳米技术与生物技术结合,磁珠主要是一些具有顺磁性的生物纳米磁珠。磁珠表面包裹一层可以发生离心交换的材料(比如羧基),从而达到吸附核酸的目的。表面的羧基与核酸通过氢键和静电作用发生特异性结合,纯化的原理是在高盐溶液中与核酸结合,在低盐环境中被洗脱。另外,磁珠在磁场的条件下发生聚集或分散,就不需要离心等人工操作。大规模检测时,可以进行自动化抽提DNA。


优点:无需有毒试剂(酚或氯仿等有机试剂),操作简便且省时,可自动化提取。获取的DNA质量好,可直接进行基因测序、PCR扩增、基因组文库构建等下游实验。灵敏度高,适合法医样本等痕量DNA提取。


缺点:成本相对较高,需要搭配磁力架。


DNA质量检测

DNA提取完后,要对纯度、浓度和完整度进行检测。常规的方法有:


凝胶电泳。可以通过琼脂糖凝胶结果判断提取的DNA是否有RNA、蛋白质、糖酚或者代谢物质等残留。另外,提取基因组DNA时通过条带是否单一明亮来判断DNA的完整度。凝胶电泳法可以通过片段亮度与DNA marker比较,粗略判断提取的DNA浓度高低。


分光光度法DNA或RNA链上碱基的苯环在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处;蛋白质在280nm处有最大吸收峰,盐和小分子集中在230nm处。利用分光光度计测量浓度的原理是,吸收强度与DNA浓度成正比。检测DNA纯度通常会检测样品的OD260、OD280和OD230值,根据它们的比值来判断DNA的纯度。


通常情况下,纯DNA的OD260/OD280比值大约1.8,大于1.9表明DNA可能存在降解或有RNA污染;小于1.7可能有蛋白残留。通常情况可以先跑琼脂糖凝胶判断DNA的纯度和完整度,然后再借助紫外分光光度计来测量浓度。


QBIT检测法。采用荧光染料与特异的靶分子结合后发出荧光,仪器接收荧光值转化为浓度数据。此方法检测相比于分光光度法更灵敏,更特异,更精确。


DNA提取纯化原理、几种常见提取方法比较、纯化后检测质量的方法,小编今天从这几个方面展开谈了DNA提取的一些细节。


千里之堤溃于蚁穴,爱基百客助力大家打好科研的基础。


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