ChIP-seq篇

1、ChIP实验推荐多少个生物学重复？

这个根据老师的实验目的来判断，如果仅仅只是想知道目标转录因子的靶结合基因，可以考虑1-2个样本进行实验；如果需要探究不同处理之间的结合差异，则推荐2-3个生物学重复。

2、ChIP-seq在找到关心的靶基因后，要怎么进行结合验证？

体内实验可以选择ChIP-qPCR；体外实验可以选择EMSA（需要有预期的结合位点序列）。此外还可以选择酵母单杂、双荧光素酶等实验（在没有目的靶点的时候，可选整个启动子进行实验）。

3、什么蛋白都可以做ChIP-seq实验吗？

ChIP-seq是用来研究转录因子/组蛋白修饰与DNA结合的测序实验，最好先确定您的预期蛋白具有结合DNA的能力（DNA Binding domain），但也会有一些蛋白能够在复合体其他蛋白的辅助下完成对DNA的调控（转录辅因子），这个也可以做，但是在数据挖掘以及验证时可以会更复杂一些。

4、ChIP实验我需要提供什么？

首先，需要保证您的目标蛋白具有同物种商业化ChIP级别的抗体，其次，保证能够寄送样本的足量性和保存条件（-80°C环境或干冰、液氮，无复融），然后需要提供总蛋白WB的检测结果（验证蛋白的正常表达及抗体的特异性；如无法进行，也可委托我们进行（定性实验）。

5、如果我的目的蛋白没有ChIP级别抗体怎么办？

首先，可以考虑构建转标签体系（如Flag、His、HA、GFP/eGFP等），这样可以利用ChIP级别的标签抗体去进行富集实验（推荐）；其次还可以自制抗体，但这类方法不推荐，无法保证富集效率，风险极大。

6、公司能够提供ChIP级别的抗体吗？

目前我们公司能够提供部分常见组蛋白修饰（H3K4Me3、H3K36Me3、H3K27Me3、H3K9Me3、H3K9Ac、H3K27Ac）以及标签（HA、Flag、GFP）抗体，其他抗体需老师自备。

7、ChIP-seq、CUT-Tag、DAP-seq有什么区别？为什么有这么多技术？

这三个技术都是用于检测蛋白与DNA互作的技术。

（1）检测环境：ChIP-seq和CUT-Tag都是体内实验，结果反应的是这个蛋白在体内的真实结合情况；DAP-seq是体外实验，相比ChIP-seq和CUT-Tag假阳性更高。

（2）检测原理：ChIP-seq利用抗体对蛋白进行免疫沉淀；CUT-Tag技术利用抗体-proteinA-Tn5对结合区域进行切割捕获；DAP-seq在体外表达Halo-蛋白，利用磁珠进行亲和纯化，不需要抗体。

（3）各自特点：

ChIP-seq：需要ChIP-seq级别抗体，对样本量要求高，适用于组蛋白修饰和转录因子

CUT-Tag：需要ChIP-seq级别抗体，对样本量要求低，更适用于组蛋白修饰

DAP-seq：采用无细胞植物麦胚表达系统，对样本量要求低，但只适用于植物的转录因子。

8、你们公司都做过哪些物种和样本的ChIP测序？（仅展示部分）

物种：在动物方面，常规的人、鼠、斑马鱼、猪、鸡、鸭、牛、线虫等，还有些不常见的褐飞虱、蟹、刺参、蚕蛹、海马等。

在植物方面，从草本到木本，如拟南芥、水稻、番茄、花山、甜瓜、嵩草、无花果等。

在微生物方面，酵母、芽孢杆菌、假单胞菌、镰刀菌等。

样本类型：动物常见的内脏组织、皮肤、卵巢、脂肪、胚胎等；植物常见的根茎叶、块茎、花蕊、原生质体、愈伤组织等。

9、ChIP-seq为什么要进行input分析？

首先，input是染色质片段化后不进行免疫沉淀的那部分DNA片段，通过后续数据分析，我们可以通过Input对照排除背景噪音（排除因本底表达水平高或一些非特异性结合所造成的假阳性peaks），验证染色质断裂的效果和整个实验中IP效果，所以Input对照是IP-seq实验必不可少的步骤。

10、生物学重复之间，能否不同的IP使用同一份input进行分析？

如果能保证生物学重复处理的一致性，可以考虑使用同一份input进行分析。