客户文章 | Nature Commun ATAC-seq助力揭示禾谷镰刀菌硝化应激反应机制

发表单位：浙江大学

发表日期：2021年5月6日

期  刊：Nature Commun（IF:17.694）

2021年5月6日，浙江大学农业与生物技术学院马中华教授团队在期刊Nature Commun（IF:17.694）发表题为“Interplay of two transcription factors for recruitment of the chromatin remodeling complex modulates fungal nitrosative stress response”的研究论文。该研究发现FgAreB是谷类作物真菌病原体禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum) NS应答的调节因子。FgAreB作为一种先锋转录因子，在NS应答相关基因的启动子上募集染色质重塑复合物SWI/SNF，从而促进其转录。此外，作者还发现一个转录抑制因子(FgIxr1)与SWI/SNF复合物竞争，从而与FgAreB结合，并负向调节NS应答。爱基百客为该研究提供ATAC-seq的技术支持。

图1  FgAreB介导禾谷镰刀菌氮胁迫的反应

2. FgAreB是Fg中NS反应的调节因子。

为了识别真菌中响应NS反应的调节器，作者筛选了超过1500个靶向SNP敏感的Fg基因缺失突变体，并且鉴定到一个在FGSG_16452位点的突变体；与野生型PH-1菌比较这个突变体对2mM的SNP和各种氮源表现出大幅增加的敏感性（图1 d）。FGSG_16452位点预测编码一个470氨基酸的蛋白，它与构巢曲霉菌的AreB有44.4%的一致性。因此，FGSG_16452此后被指定为FgAreB。FgAreB含有一个典型的锌指GATA结合区域（图1 e），它在许多其他真菌中都是保守的。

Fg包含5个典型的GATA转录因子：FgAreB、FgAreA、FgSreA、FgWC1和 FgWC2。早先研究表明FgWC1和 FgWC2突变没有导致表型变化。作者因此检测了FgAreA和FgSreA突变体对2mM SNP的敏感性，它们皆没有敏感性。这暗示FgAreB可能是Fg中唯一响应NS的GATA型转录因子。为了证实GATA结合域在FgAreB中的作用，作者首先构建了FgAreB缺失突变体（ΔFgAreB）。实验结果表明GATA结构域对FgAreB功能是必须的，但是它对其定位不是必不可少的。

为了进一步验证FgAreB与NS应答的关联，作者测定了NO在ΔFgAreB中的积累。显微镜检查显示ΔFgAreB的NO积累量远高于生长在MM-N培养或没有SNP和各种氮源的培养基上的野生型菌株（图1 f）。表型分析显示ΔFgAreB在分生孢子中严重受损，无法产生外胚层，与野生型PH-1用10 mM SNP处理的表型类似。此外，ΔFgAreB突变体含有丙二醛水平高于用10mM SNP处理的野生型菌PH-1（图1g）和硝基酪氨酸（图1h），这两个都是NS反应的标记物。总之，这些结果暗示FgAreB参与调控Fg中的NS反应。

3. FgAreB可调控Fg中NS应答基因的转录。

此前研究表明，五组NS应答基因负责消除真菌中的NO，比如黄素血红蛋白（FHB，flavohaemoglobins）、S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）、P450 一氧化氮还原酶（NOR）、胆色素原脱氨酶（HEMC）和nitrosothionein。BLASTp分析显示Fg含有5个NS响应基因，比如FgFHB1、FgFHB2、FgGSNOR、FgNOR和FgHEMC。除了FgHEMC，4个基因（FgFHB1、FgFHB2、FgGSNOR和FgNOR）在野生型菌中受到10mM SNP的诱导表达，但ΔFgAreB突变体没有，暗示FgAreB调控这4个NS响应基因的转录。

为了阐明这些FgAreB-依赖的NS应答基因是否在基因上参与消除NS，作者构建了这些基因的单、双和三重突变体。作者发现两个三突变体ΔFgNSR1（ΔFgFHB1-FHB2-GSNOR）和ΔFgNSR2（ΔFgFHB1-GSNOR-NOR）对2mM SNP和各种氮源的敏感性显著提高（图2b）。此外，与野生型比较三重突变体积累了更高水平的NO（图2c）、硝基酪氨酸（图2d）和丙二醛（图2e）。这些结果表明FgFHB1、FgFHB2、FgGSNOR、FgNOR参与消除Fg中的NS。生物信息学分析显示这四个基因的启动子包含推定的FgAreB结合顺式元件（图2f）。EMSA实验结果暗示FgAreB在体外特异地结合顺式元件。ChIP-qPCR实验显示在互补菌株中FgAreB-GFP在4个NS响应基因启动子上显著富集，但不在FgHEMC上富集。

为了进一步探索FgAreB是否在缺乏NS的情况下富集包裹核小体DNA的启动子区域，作者在没用SNP处理的野生型菌中进行MNase-qPCR实验。结果显示含有FgGSNOR的FgAreB结合顺式元件(- 380 ~ - 220)的启动子区包裹在一个核小体上（图2h），暗示FgAreB能够在核小体包裹处DNA区域富集。这些结果表明FgAreB能够富集在核小体包裹的DNA区域。

图2 FgAreB调节禾谷镰刀菌的硝化应激反应基因

4. FgAreB通过与FgSwp73直接相互作用与SWI/SNF复合物关联，介导Fg对NS的应答。

为了进一步阐明FgAreB对NS响应的调控机制，作者以Fg cDNA文库为猎物，FgAreB为诱饵，进行酵母双杂交(Y2H)筛库，筛选FgAreB潜在的相作蛋白。在筛选过程中共获得51个假定的FgAreB相互作用蛋白。其中FgSwp73，酿酒酵母Swp73的同系物，是SWI/SNF染色质重塑复合物的核心成分。利用酵母SWI/SNF复合物的亚基进行BLASTp搜索，在Fg中发现了10个SWI/SNF亚基。

     Y2H分析显示FgAreB只与FgSwp73相互作用，而与该复合物的其他亚基不相互作用（图3a），而FgSwp73与 FgSnf2、FgSnf5、FgSwi3、FgSwi1和FgArp7互作（图3b）。这些结果表明，FgAreB极有可能通过与FgSwp73相互作用与SWI/SNF复合物关联。此外，通过一系列截短FgAreB的Y2H实验和GST-pull-down试验表明，FgAreB的GATA结构域对其与FgSwp73的相互作用至关重要（图3c）。此外，蛋白质亚细胞定位实验表明FgAreB与SWI/SNF核心亚FgSwp73、FgSnf2和FgSnf5共定位（图3d）。Co-IP实验进一步证实在体内FgAreB与FgSwp73、FgSnf2和FgSnf5互作，它们的互作关系在SNP处理后得到加强（图3e）。总之，这些结果暗示FgAre通过与FgSwp73直接互作关联SWI/SNF复合物。

     为了探索FgAreB与SWI/SNF复合物的遗传关联，作者尝试构建每个SWI/SNF亚基的缺失突变体。10个亚基中，6个亚基（FgSwi3、FgSwi1、FgArp9、FgSwp82、FgSnf5和FgTaf14）成功去除，而剩余4个亚基（FgSwp73、FgArp7、FgSnf6和FgSnf2）没有去除，暗示这4个亚基可能对Fg生长所必须。表型分析表明，FgSnf5突变体对2mm SNP和各种氮源的敏感性显著提高（图3f），而FgArp9突变体对SNP敏感。对FgSnf5突变体的进一步鉴定表明，与野生型比较该突变体积累了更高水平的NO（图3g）、丙二醛（图3h）和nitrotyrosine（图3i）。突变体中4个NS应答基因也显著下调。ChIP-qPCR结果显示，SNP处理可促进这些基因启动子处FgSnf5-GFP的富集（图4a）。这些结果表明SWI/SNF复合物至少部分通过调节NS应答基因的转录调控NS应激反应。

图3 FgAreB与SWI/SNF复合物共同调控NS应答基因的转录

5. FgAreB通过招募SWI/SNF复合物调节染色质可及性。

既然SNP处理可以增强FgAreB与SWI/SNF复合物的关联，作者推测FgAreB可能将该复合物招募到NS应答基因的启动子并激活其转录。为了验证这一假设，作者利用ChIP-qPCR分析衡量FgSnf5在FgAreB缺失突变体中NS响应基因启动子上的占有情况。SNP处理显著促进了野生型菌株（PH-1::FgSnf5-GFP）NS应答基因启动子上FgSnf5-GFP的富集，但在ΔFgAreB菌株中没有，这暗示FgSnf5的富集大大地依赖于FgAreB（图4a）。相反，FgAreB-GFP在NS响应基因启动子上的富集不受FgSnf5和SNP处理的影响（图4b；图2g）。此外，ChIP-qPCR和MNase-qPCR实验显示不管是否用SNP处理在ΔFgAreB和ΔFgSnf5突变体中在FgGSNOR启动子FgAreB结合位点上的核小体占有率高于野生型菌朱PH-1（图4c，d），这表明FgGSNOR启动子上的核小体在没有FgAreB或FgSnf5的情况下无法有效退出。此外，FgAreB或FgSnf5基因不影响彼此的转录。这些结果表明FgAreB可能是将SWI/SNF复合物招募到NS应答基因启动子的先锋TF。

考虑到ΔFgAreB和ΔFgSnf5的生长缺陷比三重突变体ΔFgNSR1和ΔFgNSR2严重得多，作者认为，除了NS反应外，FgAreB和FgSnf5可能还参与了Fg其他功能的调控。生长在传统培养基PDB中的ΔFgAreB和ΔFgSnf5突变体RNA-seq数据反映FgAreB和FgSnf5共激活657个基因，共抑制1431个基因（图4e）。与RT-PCR结果一致，在这两个ΔFgAreB和ΔFgSnf5突变体中NS响应基因FgFHB1、FgFHB2和FgNOR显著下调。下调基因的GO富集分析暗示FgAreB和FgSnf5参与一些关键代谢过程，包括ADP、嘌呤核苷和核苷、吡啶核苷、单糖，这可能部分解释ΔFgAreB和ΔFgSnf5突变体严重生长缺陷。

为了进一步验证FgSnf5和FgAreB在调控染色质可及性的作用，作者利用ATAC-seq技术构建了染色质景观图谱。如图4f，与野生型菌株比较，FgAreB或FgSnf5缺失分别导致2050或1236个不可进入genome peaks。1051个peaks由FgAreB和FgSnf5共调控，在ΔFgSnf5突变体中超过83%不可及peaks在ΔFgAreB中也不可及（图4f）。另外一方面，与野生菌株相比，ΔFgAreB和ΔFgSnf5突变体分别增加了1494和2063个可及peaks。其中802个增加的可及peaks由由FgAreB和FgSnf5共调控（图4f），意味着ΔFgSnf5突变体中38.9%增加可及peaks在ΔFgAreB突变体中也开放。以峰为中心的热图也表明，ΔFgAreB中染色质不可接近的峰值与ΔFgSnf5的高度重叠（图4g，h）。综上所述，这些结果表明FgAreB与FgSnf5协同主要调节染色质可及性，尽管它们也在调控染色质不可及性方面发挥作用。

图4 FgAreB通过激活SWI/SNF复合物来调控基因表达和染色质可及性

6. FgIxr1与FgAreB竞争性相互作用，阻止FgAreB与SWI/SNF复合物相互作用。

在cDNA文库筛选实验中，筛到FgAreB另外一个互作蛋白——FgIxr1，是酿酒酵母中的一个同源基因，编码一个转录抑制因子。表型分析显示FgIxr1突变体（ΔFgIxr1）与野生型相比，对10 mM SNP的抗性增强（图5a）。在ΔFgIxr1突变体响应SNP处理，NS响应基因的转录水平高于野生型（图5b），暗示FgIxr1可能负调控NS反应。ChIP-qPCR检测结果显示，SNP处理后，FgGSNOR基因启动子上FgIxr1-GFP富集显著减少。

为了阐明FgIxr1对NS应答基因的转录抑制机制，作者首先检查了Fglxr1的定位，且发现在MM-N条件下FgIxr1-mCherry与FgAreB-GFP共定位在核内，它们之间的互作关系由酵母双杂交和Co-IP实验确定（图5d，e）。FgAreB的GATA结构域对这个互作非常关键（图5d-f），因为将FgAreB截短去掉GATA结构域与FgIxr1的互作显著减少（图5d，e）。考虑FgAreB的GATA结构域对其与FgSwp73的互作非常关键，作者推测在与FgAreB的互作中FgIxr1可能与FgSwp73竞争。作者进行了酵母双杂交、酵母三杂交、pull-down实验、Co-IP等证实了这一推测。为了进一步了解FgIxr1调控NS应答基因转录的机制，我们测定了FgIxr1在SNP处理下的转录和翻译水平。作者利用RT-PCR、荧光显微镜等手段发现SNP处理可能促进FgIxr1的降解。

图5 FgIxr1和FgSwp73与FgAreB相互竞争

7. FgAreB和FgSnf5是禾谷镰刀菌毒力所必需的。

为了确定病原真菌的NS反应是否对毒力有重要影响，作者检测了ΔFgAreB、ΔFgSnf5、 ΔFgNSR1、ΔFgNSR2和ΔFgIxr1对开花小麦穗和小麦胚芽鞘的毒力水平。两个ΔFgAreB和ΔFgSnf5对小麦穗和胚芽鞘无致病作用；而ΔFgIxr1、ΔFgNSR1和ΔFgNSR2均显示毒性降低（图6a，b）。此外，由于禾谷镰刀菌的NS应激基因负责抵抗NS，在真菌侵染12小时时这些基因在PH-1和ΔFgIxr1中的表达高于那些ΔFgAreB和ΔFgAreB（图6c）。

之前的研究表明NO也能激活植物防御相关基因的转录，因此作者检测了侵染后小麦幼苗叶片中防御相关基因的表达。用ΔFgAreB、ΔFgSnf5、ΔFgNSR1和ΔFgNSR2突变体侵染后小麦细胞的基因TaPR1、TaPR5和TaWRKY23表达高于那些用PH-1和ΔFgIxr1（图6d）。作者还研究了突变体的毒素形成。ΔFgAreB和ΔFgSnf5在TBI培养基和小麦组织上不能形成正常的绿色球形和新月形毒素体，而PH-1和互补菌株可以形成毒素体（图6e）。ΔFgAreB和ΔFgSnf5突变体中FgTri1-GFP的GFP信号无法监测到（图6f），与野生型比较ΔFgAreB、ΔFgSnf5、ΔFgNSR1和ΔFgNSR2突变体的DON产量明显减少（图6g）。总之，这些结果暗示对NS的敏感性增加和DON产量的减少可能有助于减弱ΔFgAreB、ΔFgSnf5、ΔFgNSR1和 ΔFgNSR2对小麦的毒性。

图6 FgAreB、FgSnf5和FgNSRs有助于禾谷镰刀菌的毒力

总结

在该研究中，作者发现FgAreB通过招募SWI/SNF复合物到靶基因启动子参与调节NS应答，作者也发现FgAreB负调控Fg中许多基因的转录。将目前的发现扩展到其他子囊菌，它肯定会为真菌中氮调节的转录机制和进化提供有趣的见解。

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