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项目文章 | IF:11.6! ChIP-seq助力揭示罗格列酮抑制FABP4缺陷型胃癌肿瘤转移的机制

发表单位：福建医科大学附属协和医院

发表日期：2022.1.24

期刊：Theranostics IF:11.6

2022年1月24日，福建医科大学附属协和医院在期刊Theranostics（IF：11.6）上在线发表了题为“The peroxisome proliferator-activated receptor agonist rosiglitazone specifically represses tumour metastatic potential in chromatin inaccessibility-mediated FABP4-deficient gastric cancer ”的研究论文。作者通过RNA-seq鉴定胃癌（GC）转移相关差异表达基因，评估GC患者中脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)的表达以及对预后影响，采用ChIP-seq、多种小鼠模型和ATAC-seq来研究FABP4作用及机制，以此找到新的治疗GC潜在靶点。爱基百客为该研究提供ChIP-seq技术支持。

研究背景

胃癌(GC)是一种高度侵袭性的疾病，其死亡率位在癌症中位居第三。尽管根治性切除结合辅助化疗可以在一定程度上改善病情，但转移和复发仍是晚期胃癌患者的主要致死因素。目前对于GC病理机制尚不清楚，所以在预防GC复发方面较为困难。

最近研究表明，FABP4可以根据癌症类型起到抗或促进肿瘤作用。目前，关于FABP4在GC中的报道较少，其在GC中作用和机制尚未完全阐明。为了深入了解FABP4影响GC转移内在机制并探索新治疗方案，作者通过生物信息学分析确定了FABP4为GC转移特异性基因，强调了FABP4在GC中的生物学意义，并证明了之前未被认识到的GC转移分子机制，表明FABP4是一个新型诊断和治疗GC的策略靶点。

文章思路

结果

FABP4下调与GC患者生存期降低和复发率增加相关

为了探索预测胃癌转移的特异性生物标志物，作者进行了对20例存在PM或非PM的复发GC患者样本进行了RNA测序，确定了5个标志物（FABP4, FHL1, LARGE2, ASCL2, and VIL1）。FABP4是研究最广泛的癌症基因，但是FABP4在GC中的作用仍然未知。RNA-seq结果显示在FABP家族成员中只有FABP4表达存在明显差异，因此选择FABP4基因进行后续实验。IHC实验结果说明FABP4表达水平在合并PM的GC病人中呈现下调。相对于正常胃组织，GC组织中FABP4的mRNA和蛋白水平均明显降低；此外，作者系统评估了FABP4水平对于GC患者预后意义。在正常组织中FABP4信号呈强阳性，肿瘤组织中FABP4信号明显下降。

临床病理分析证明FABP4表达水平降低与病理特征相关，例如肿瘤体积增加、分化状态降低以及TNM分期升高。FABP4低表达患者预后情况较FABP4高表达患者差。多变量回归分析结果显示FABP4表达是GC患者总生存期的独立预后因素。此外，作者还分析了接受切除术治疗的胃癌患者术后复发模式与FABP4表达的关系。结果证实，FABP4低表达与淋巴结、肝脏、腹膜和整体复发模式显著相关。FABP4低表达组的总复发累积发生率高于FABP4高表达组。这些结果证明FABP4表达与GC患者复发及预后相关。

图1 FABP4在人胃癌中的异常表达及其临床意义

FABP4在体外和体内均可减弱GC转移

为了研究FABP4对人GC细胞系影响，作者使用FABP4过表达和敲除两种细胞。结果显示FABP4表达明显抑制GC细胞迁移和侵袭，增加细胞粘附度，同样，抑制FABP4表达可以起到相反效果。但是FABP4过表达和敲除并不影响GC细胞增殖和凋亡。为了进一步测试体内FABP4对转移潜能的影响，使用了肺转移小鼠模型。结果显示，FABP4上调可抑制胃癌细胞转移，下调会促进转移。此外，作者还将GC细胞注入裸鼠的脾脏，诱导肝转移的形成。肝解剖检查显示，FABP4过表达组肿瘤病灶数量低于对照组，当FABP4敲除后结果相反。皮下植入胃癌模型与体外实验结果一致，FABP4对移植瘤的生长无影响。总的来说，这些结果表明FABP4是胃癌转移的强抑制因子，不促进肿瘤生长。

图2 FABP4显著抑制GC细胞的转移能力

CADM3是FABP4的关键功能靶点

鉴于FABP4在GC转移和临床结果预测中的关键作用，作者使用RNA-seq进行了生物信息学分析，以进一步了解潜在分子机制。分别通过对高表达和低表达FABP4样本进行分析，发现细胞粘附基因CADM3的水平与FABP4水平呈显著正相关。对36份独立的GC标本进行RT-qPCR分析，进一步证实FABP4与CADM3之间存在正相关。组织微阵列免疫组化分析结果表明FABP4低表达组中CADM3水平较低。

以往研究表明，CADM3与肿瘤发生有关，在胶质瘤和其他几种癌症中显示出抑制肿瘤特性。然而，CADM3在GC中的角色功能尚不清楚。CADM3低表达患者预后较CADM3高表达患者差。为了证明FABP4抗肿瘤效应是否受到CADM3介导，作者构建CADM3真核表达载体，使用靶向作用CADM3的siRNAs（siCADM3）。结果表明，CADM3表达下调和siCADM3表达上调可以增加GC细胞迁移和侵袭能力。为了进一步研究CADM3在GC细胞转移过程中作用，作者通过先敲除CADM3，随后再重新引入FABP4，结果表明GC细胞侵袭能力并没有呈现明显差异，当CADM3过表达或同时阻碍FABP4表达时，GC细胞侵袭结果也不存在差异，此结果说明CADM3是在FABP4下游发挥作用。

为了进一步探究FABP4和CADM3之间调控关系。采用ChIP-seq探究FABP4在CADM3启动子区域结合位点，结果显示在CADM3启动子区域并没有FABP4富集，说明在GC细胞中FABP4无法直接促进CADM3转录。此外，基因富集分析(GSEA)结果表明，FABP4高表达的GC样品中上调最显著的分子标记包括过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路相关的基因集。

PPAR是一组依赖配体的核转录因子，包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR –γ。为了验证PPARs是否会影响CADM3表达，结果表明PPAR-γ激动剂-罗格列酮可显著提高CADM3的表达。以上这些结果均表明，CADM3是介导FABP4在GC中保护作用的关键分子。作者认为在低表达FABP4的GC中，PPAR-γ转录因子失活很可能抑制CADM3。

图3 鉴定CADM3是FABP4的功能靶标

FABP4促进核受体PPAR-γ调控CADM3表达

既往研究表明PPAR-γ常作为配体依赖的转录因子调控下游靶基因。作者假设FABP4是PPAR-γ的配体，可以直接与PPAR-γ结合并介导FABP4相应生物学作用。共免疫共沉淀实验结果表明，异位表达的Flag-FABP4与内源性PPAR-γ在GC细胞中存在互作。采用免疫荧光法分析FABP4表达对PPAR-γ亚细胞定位的影响，FABP4的异位表达诱导PPAR-γ从细胞质转到细胞核。WB实验结果显示FABP4表达水平上调可以提高PPAR-γ表达。FABP4过表达显著增加PPAR-γ的半衰期。

此外，蛋白酶体抑制剂MG132的实验结果表明，FABP4可降低内源性PPAR-γ的降解。在MGC-803细胞中罗格列酮可以激活PPAR-γ。此外，罗格列酮可以在mRNA和蛋白水平影响CADM3表达，并且呈现一定的时间和剂量依赖效应。然而，FABP4的表达不受罗格列酮处理的影响(图4G)，表明PPAR-γ介导FABP4调控CADM3的表达。

然后，作者研究了PPAR-γ是否在转录水平上直接调控CADM3表达。通过生信预测发现CADM3基因启动子上存在PPRE 区域。然后，作者构建了CADM3启动子荧光素酶报告基因质粒，双荧光素酶实验结果证明CADM3基因启动子会被PPAR-γ激活。上述结果表明，FABP4以配体的形式与转录因子PPAR-γ结合，增强其转录活性，直接促进CADM3在GC中的表达。

图4 FABP4促进PPAR-γ介导的CADM3转录

罗格列酮是一种治疗FABP4缺陷GC的潜在抗肿瘤药物

为了验证FABP4介导的GC转移机制，作者对MGC-803胃癌细胞进行了一系列挽救实验。结果表明，在PPAR-γ siRNA转染的细胞中，FABP4诱导GC细胞CADM3表达上调对侵袭和迁移抑制作用会减弱。罗格列酮可以有效逆转因FABP4缺陷引起的GC细胞中CADM3表达下调和侵染性增加的情况。

作者构建BALB/c裸鼠模型，其肿瘤来自于尾静脉注射的FABP4缺失的BGC-823细胞,随后采用DMSO和罗格列酮处理。生物发光成像仪显示罗格列酮可以明显抑制肿瘤转移。第28天取出肺组织，结果显示罗格列酮治疗组肺中肿瘤结节数量明显降低。在肝脏转移小鼠模型中，采用罗格列酮处理后可以有效减少肝脏中结节数量。总之，这些结果表明罗格列酮在体内外均可以逆转FABP-4缺陷所导致的GC细胞转移能力增强的情况。

图5 罗格列酮在体内外均可逆转FABP4缺陷型GC细胞的转移能力

罗格列酮治疗与GC患者复发风险的相关性

为了评估罗格列酮治疗是否与胃癌根治切除术后复发有关，作者收集了GC患者使用抗糖尿病药物的信息，在352例GC患者中，23例诊断为糖尿病，其中5例接受罗格列酮治疗。FABP4表达较低的患者在接受罗格列酮治疗后复发率较低，生存率较未接受罗格列酮治疗的患者高，然而，FABP4高表达患者并未从罗格列酮治疗中受益。结果说明罗格列酮的抗肿瘤作用因人群类型而异。

图6 罗格列酮在FABP4低表达患者中的潜在抗肿瘤作用

染色质不可接近可能通过HDAC1过表达而降低FABP4的表达

由于GC组织中FABP4表达低于正常组织，为了进一步探究FABP4出现差异原因。作者使用cBioPortal分析TCGA数据库中FABP4改变频率和类型。进一步分析表明，拷贝数变异(CNV)或突变并不是FABP4表达改变的主要原因。此外，FABP4的表达与其启动子的甲基化无关。通过转座酶可接近染色质的高通量测序（ATAC-seq）分析染色质可及性，意外地发现FABP4在GC组织中具有较低染色质可接近性，这意味着GC中FABP4的低表达可能是由于染色质可及性降低，而不是由CNV、突变或DNA甲基化引起的。考虑到组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的活性与染色质可及性和基因异常表达密切相关，作者分析了TCGA和GSE15459数据库中HDACs和FABP4之间的相关性，只有HDAC1的表达与FABP4的表达显著相关。采用HDAC抑制剂（LAQ824）检测FABP4表达的改变，结果显示，HDAC1受到抑制后FABP4表达增加。通过对475例样本研究，发现HDAC1和FABP4以及HDAC1和CADM3均呈现负相关。综上所述，FABP4在GC中的表达下调是由于染色质可及性降低导致的，并与HDAC1相关。