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项目文章 | IF>9 !ChIP-seq和RNA-seq联合分析揭示 NrtR介导的铜绿假单胞菌H1-T6SS调控

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发表单位:南开大学生命科学学院

发表日期:2022年2月23日

发表期刊:Microbiol Spectr(IF:9.043)

研究材料:铜绿假单胞菌

研究技术:ChIP-seq、RNA-seq、EMSA等(爱基百客均可提供)



2022年2月23日南开大学生命科学学院在期刊Microbiol Spectr(IF:9.043)发表题为“NrtR Mediated Regulation of H1-T6SS in Pseudomonas aeruginosa”的研究论文。该研究利用ChIP-seq技术证明NrtR通过直接结合tssA1启动子以及通过RsmY/RsmZ-RsmA/RsmN通路调控H1-T6SS基因的表达。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持


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01

研究背景


铜绿假单胞菌为条件致病菌,是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者,以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。该细菌具有多种蛋白质分泌系统,有助于其发病机制和在宿主环境中的竞争优势。III型分泌系统(T3SS)是一个关键的毒力决定因素,作者此前的研究表明铜绿假单胞菌通过cAMP/Vfr通过控制T3SS的表达[1];而VI型分泌系统(T6SS)是铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的一种蛋白质分泌机制,它将效应蛋白传递到邻近的真核或原核细胞中,对细菌和宿主均起作用。作者在研究中发现nrtR突变导致Hcp分泌岛类型VI系统(H1-T6SS)的上调,研究想弄清楚其中的调控机制。



02

研究思路



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03

研究结果

1. nrtR突变使铜绿假单胞菌H1-T6SS基因表达增加


为了确定nrtR在铜绿假单胞菌中的全局调控作用,作者利用RNA-seq比较分析野生型菌株PAK和它的△nrtR突变体的全局转录组。转录组分析结果显示△nrtR突变体中H1-T6SS操纵子的大部分基因以及它的分散效应器/免疫蛋白上调表达(表1)。


为了了解nrtR与铜绿假单胞菌H1-T6SS基因之间的关系,作者采用real-time qPCR验证Hcp-编码基因(铜绿假单胞菌H1-T6SS的标记基因)的mRNA水平(图1)。△nrtR突变体中hcp1 mRNA的水平增长了6.1倍,并且可以与野生型nrtR基因互作恢复到野生型PAK菌株的水平。蛋白实验也进一步支持这一结果(图1B)。作者还做了细菌竞争分析,比较了铜绿假单胞菌和大肠杆菌竞争生长的情况。这些结果证实nrtR突变使铜绿假单胞菌H1-T6SS基因表达增加。

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图1 Hcp1在△nrtR突变体中表达上调。

2. rsmY/rsmZ上调导致△nrtR突变体中的H1-T6SS增加


由于NrtR通过控制cAMP/Vfr途径控制T3SS的表达,作者想知道△nrtR突变体中的H1-T6SS的增加是否由于细胞cAMP水平的降低。为了验证这一点,作者检测了突变体△cyaA△cyaB和△vfr中H1-T6SS的表达情况,这些突变体也表现出细胞内cAMD含量减少。Real-time qPCR结果显示与野生型比较这两个突变体中hcp1和tssA1都表现出mRNA水平减少。这些结果表明H1-T6SS的上调并不是因为△nrtR突变体中的cAMP水平减少。


铜绿假单胞菌中H1-T6SS的表达被证明是受细胞内c-di-GMP控制,它与cAMP信号通路有关。作者此前报道过△nrtR突变体cAMP水平显著降低;因此,作者想研究ntrR是否影响细胞内c-di-GMP水平。表面粘附CdrA的表达受细胞内c-di-GMP的调控;因此,其表达水平被作为细胞内c-di-GMP水平的指标。Real-time qPCR结果表明NrtR对铜绿假单胞菌细胞内的c-di-GMP的水平没有影响。


铜绿假单胞菌中小RNAs RsmY和RsmZ调控H1-T6SS的表达。为了验证nrtR是否通过RsmY和RsmZ抑制H1-T6SS,作者比较了突变体中这些sRNAs的mRNA水平以及EGFP蛋白水平。结果暗示在△nrtR突变体中RsmY和RsmZ表达上调(图2B)。

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图2 RsmY/RsmZ上调导致△nrtR突变体的H1-T6SS升高


为了验证RsmY和RsmZ对NrtR介导的H1-T6SS的调控作用,作者构建了△nrtR△rsmY和△nrtR△rsmZ双突变体,以及△nrtR△rsmY△rsmZ三突变体,并检查它们的H1-T6SS表达。Real-time qPCR和蛋白表达实验结果暗示NrtR通过小RNAs RsmY和RsmZ抑制H1-T6SS。


3. △nrtR突变体中超表达rsmA/rsmN可恢复H1-T6SS的表达


由于RsmY和RsmZ的主要作用是隔离和降低自由RsmA和RsmN,它们是两个CsrA家族RNA结合蛋白,作者研究了RsmA和RsmN的异位表达是否可以恢复△nrtR突变体中的H1-T6SS表达。首先,real-time qPCR用来确定hcp1的转录水平。如预期,超表达rsmA或rsmN可降低△nrtR突变体中相对mRNA水平(图3A和B)。


此外,带Flag标签hcp1转入PAK和它的△nrtR衍生菌。Western blot检测Hcp1的表达。与real-time qPCR结果一致,超表达rsmA或rsmN会降低△nrtR突变体中Hcp1-Flag的数量(图3C)。这些结果暗示NrtR影响RsmA/RsmN介导的H1-T6SS调控。

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图3 △nrtR突变体中超表达rsmA/rsmN可恢复H1-T6SS的表达


4. NrtR直接结合rsmY/rsmZ的启动子


为了了解NrtR介导的rsmY/rsmZ调控,作者进一步研究了NrtR是否影响rsmY/rsmZ基因上游的已知调控基因的表达,如gacA、gacS、ladS、retS、algR和amrZ。RNA-seq分析和real-time qPCR结果表明这些基因的mRNA水平并没有改变。


为了进一步阐明NrtR调控rsmY/rsmZ的分子机制,作者进行了ChIP-seq分析。首先,构建了一个表达质粒——pUCP24-nrtR,它能够恢复△nrtR突变体中H1-T6SS的表达。然后,对包含这个表达质粒的△nrtR突变体进行ChIP-seq。与此前的报道结果一致,NrtR结合到nadD2和pcnA之间的基因间区(表2),基因间区富集倍数是2.21倍。值得注意的是,NrtR的潜在结合靶点包括rsmY和rsmZ基因的上游序列(表2)。EMSA结果进一步验证NrtR与候选启动子区域的结合。

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图4 NrtR直接结合rsmY、rsmZ或tssA1的启动子。EMSA检测确定NrtR与nadD2(A)、rsmZ(B)、rsmY(C)、tssA1(D)或NrtR内部区域。



5. NrtR直接结合tssA1启动子并抑制tssA1的表达


除了rsmY和rsmZ,作者的ChIP-seq数据显示tssA1的启动子也是NrtR的潜在结合靶点(表2)。根据RNA-seq分析结果(表1),△nrtR突变体中tssA1的转录水平增长了9.6倍。因此,NrtR可能直接结合到tssA1启动子并抑制其表达。为了验证这种推论,作者首先利用实时qPCR证实了△nrtR突变体中tssA1转录水平的增长。结果与RNA-seq的结果一致(图5A)。在△nrtR突变体背景下,PtssA1介导的EGFP蛋白水平与mRNA表达水平一致(图5B)。


为了进一步证实NrtR对tssA1的直接抑制,nrtR克隆进pET28a并与PtssA1-EGFP共转入大肠杆菌BL21。实时qPCR和western结果暗示NrtR对tssA1的直接抑制作用。为了进一步验证NrtR与tssA1启动子区域的直接结合,作者使用tssA1启动子区域对应的片段进行了EMSA。类似于rsmY和rsmZ,与NrtR孵育后,tssA1启动子区域检测到一条延迟带,但NrtR的DNA片段没有(图4),表明NrtR特异性结合H1-T6SS操纵子的启动子区域。

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图5 NrtR直接抑制tssA1


04

研究结论

在该研究中,作者证明铜绿假单胞菌NrtR抑制H1-T6SS基因的表达。深入的研究发现NrtR通过与tssA1启动子结合直接调控H1-T6SS,并通过直接调控rsmY和rsmZ转录间接调控RsmY/RsmZ-RsmA/RsmN通路来调控H1-T6SS。作者还提出了铜绿假单胞菌的nrtR基因功能的模型(图6)。


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图6 铜绿假单胞菌nrtR介导的调控模型


ChIP-seq作为爱基百客的王牌产品,拥有丰富的项目经验。有相关需求的老师可以和我们联系。


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