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项目文章 | 园艺学顶刊Horticulture Research发表HSFA2的自然变异增强了葡萄的耐热性机制

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发表期刊:Horticulture Research

影响因子:7.291
发表日期:2022.11.10
发表单位:中国科学院植物研究所




2022年11月10日中国科学院植物研究所葡萄科学昆虫重点实验室北京植物资源重点实验室在期刊Horticulture Research上发表一篇名为“Natural Variations of HSFA2 enhance thermotolerance in grapevine”的研究论文。作者利用ChIP-seq、亚细胞定位、RNA-seq、ChIP-qPCR、酵母单杂交和双荧光素酶测定以及酵母双杂交技术,揭示了HSFA2的自然变异增强了葡萄的耐热性,并通过调节MBF1c表达发挥作用爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持

01 研究背景

葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上非常受欢迎的水果,具有重要的经济价值。然而,热胁迫会对葡萄品质和产量产生有害影响。随着葡萄基因组的发表,有一些关于热胁迫引起的形态和生理变化的研究,但是关于葡萄热胁迫的信息有限。

先前的研究表明,热胁迫后HSFA2的表达在转录和蛋白质水平上增加,表明HSFA2可能在葡萄耐热性中发挥潜在作用。然而,我们缺乏HSFA2诱导葡萄耐热性的遗传证据。同时,几乎没有任何报道表明HSF的等位基因变异导致不同植物(或材料)的耐热性差异,特别是HSFA2。此外,HSFA2如何调节下游基因增强包括葡萄在内的植物的耐热性仍有待探索。MBF1是一种高度保守的转录辅激活因子,在发育过程和应激反应中起着至关重要的作用。然而,MBF1c的功能尚未在葡萄树中得到验证,植物中哪种转录因子直接调节MBF1c仍然未知。

02 研究思路

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03 研究结果

1. 高温条件下HSFA2在葡萄和刺葡萄叶片中的表达及启动子活性研究

作者对葡萄‘京秀’和刺葡萄‘塘尾’进行40℃和45℃处理2 h后,与对照(25℃)相比,通过qRT-PCR发现叶片中HSFA2的表达量显著升高,且在‘塘尾’中的表达高于‘京秀’(图1a)。在拟南芥原生质体中进行了VvHSFA2VdHSFA2启动子的瞬时表达试验,发现在不同条件下VdHSFA2启动子的相对活性均高于VvHSFA2(图1b,c,d)。

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图1.葡萄‘京秀’和刺葡萄‘塘尾’中HSFA2在不同温度下的表达及启动子活性研究


2. VvHSFA2和VdHSFA2的序列分析、亚细胞定位及转录活性

作者通过对VvHSFA2和VdHSFA2的序列分析发现,VvHSFA2和VdHSFA2有11个SNPs在DBD、HR-A/B和AHA结构域的7个氨基酸残基存在差异(图2a)。亚细胞定位发现过表达VvHSFA2-GFP和VdHSFA2-GFP均定位在细胞核上(图2b)。酵母单杂实验说明VvHSFA2和VdHSFA2在酵母中均具有转录活性(图2c)。在拟南芥原生质体中使用双荧光素酶报告基因进行了类似的检测(图2d)。其中与VvHSFA2相比,VdHSFA2的荧光素酶活性更高(图2e)。

为进一步探索哪些SNP可以解释VvHSFA2和VdHSFA2之间观察到不同的反式激活特性,作者进行了氨基酸序列比对(图2g),并通过双荧光素酶实验发现由HSFA2编码区944碱基C/T核苷酸多态性引起的VdHSFA2mut1 (Thr315→Ile315)的转录活性明显低于VdHSFA2野生型(图2f)。为了探究葡萄的耐热性是否与VdHSFA2mut1基因相关,作者测定了41份葡萄材料的耐热性,并对每个种质的HSFA2亚型进行克隆和测序,发现在38份葡萄品种中均存在等位基因Ile315,而在两个耐高温的刺葡萄和一个耐高温的五角叶葡萄中均含有等位基因Thr315(表1)。

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图2.葡萄‘京秀’(VvHSFA2)和刺葡萄‘塘尾(VdHSFA2) HSFA2的保守motif、亚细胞定位和转录活性


表1.葡萄HSF A2中SNP与耐热性的关系

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3. VvHSFA2和VdHSFA2对葡萄耐热性的影响

  作者为了研究HSFA2的功能,通过eGFP荧光和RT-qPCR鉴定,获得过表达VvHSFA2 (OE-VvHSFA2)和VdHSFA2 (OE-VdHSFA2)的转基因葡萄悬浮细胞(图3a, b)。OE-VvHSFA2和OE-VdHSFA2葡萄悬浮细胞在25°C的条件下生长,外观与EV细胞相似,然而对照细胞(EV)在45°C培养2小时后变成黑色,在25°C培养7 d后恢复(图3c)。通过对热应激恢复后的EV和转基因悬浮细胞的鲜重测定,发现HSFA2转基因细胞的鲜重下降比例低于EV细胞,说明过表达VvHSFA2和VdHSFA2显著提高了葡萄的耐热性,其中VdHSFA2效果较好(图3d)。同时在组培苗中瞬时表达也得出了相同结论。在本氏猪笼草中瞬时过表达VvHSFA2和VdHSFA2,HSFA2表达水平无显著性(图3e)。HSP22.0基因被HSFA2反式激活,测量了HSP22.0的表达水平,发现OE-VvHSF A2中HSP22.0表达水平比OE-VdHSF A2增加较少图3f)。

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图3.过表达VvHSFA2和VdHSFA2提高葡萄的耐热性。


为了进一步探讨HSFA2对葡萄耐热性的作用,作者研究了HSFA2被CRISPR-Cas9敲除的葡萄悬浮细胞的耐热性。sgRNA如图所示(图4a)。通过测序检测突变的HSFA2葡萄悬浮细胞,如图所示(图4b),取了10个样本,其中8个样本被编辑,并导致5个类型突变,突变的氨基酸序列如图所示(图4c)。正如预期的那样,当在25°C下生长时,HSFA2悬浮细胞的外观与空载葡萄悬浮细胞相似;相比之下,HSFA2悬浮细胞在45°C下80分钟后变黑,25°C下7天恢复(图4d)。热处理和恢复后,HSFA2的鲜重低于对照细胞,且均显著降低(图4e)。以上结果表明,HSFA2葡萄悬浮细胞比对照细胞对热胁迫更敏感。

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图4.HSFA2基因的敲除降低了葡萄的耐热性


4. VvHSFA2和VdHSFA2靶向的潜在基因

作者为了研究VvHSFA2和VdHSFA2的靶基因,进行了ChIP-Seq分析。VdHSFA2结合峰区的注释显示,38.8%被映射在启动子区(图5a,b)。接着用Homer软件鉴定了HSFA2结合的DNA基序,VdHSFA2和VvHSFA2最显著富集的基序是基序1(核心序列TTCNNGAANNTTCNN)(图5c)。在VdHSFA2 ChIP-Seq测定中,鉴定的2040个峰对应于1879个基因,而在VvHSFA2 ChIP-Seq测定中,621个峰对应353个基因(图5d,e)。ChIP-Seq和RNA-Seq数据的联合表明,VdHSFA2可能直接调控116个基因,其中96个基因上调,20个基因下调(图5d)。VvHSFA2可直接调控36个基因,其中35个基因上调,1个基因下调(图5e)。


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图5.通过ChIP-Seq和RNA-Seq对VdHSFA2和VvHSFA2靶向基因进行全基因组分析


5. HSFA2通过调节MBF1c表达调控葡萄的耐热性

MBF1c是一种高度保守的转录辅因子,在包括耐热性的多种过程中发挥重要作用。在作者研究中,MBF1c属于VdHSFA2和VvHSFA2调控基因的列表(图5f)。为了评估HSFA2是否能够调节MBF1c的表达,并探讨VdHSFA2和VvHSFA2之间是否存在MBF1c调节效率的差异。作者首先通过酵母单杂交试验(Y1H)和ChIP-qPCR证明了VvHSFA2和VdHSFA2都可以直接与MBF1c启动子相结合(图6a,b,c);通过荧光素酶(LUC)报告试验表明,VvHSFA2和VdHSFA2可以在体内直接与MBF1c的启动子结合,并且VdHSFA2对MBF1c转录激活能力强于VvHSFA2(图6d,e,f)。

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图6.VvHSFA2和VdHSFA2正调节MBF1c的表达

6. MBF1c特性的鉴定和MBF1c诱导葡萄耐热性的验证

通过qRT-PCR分析MBF1c分别在葡萄‘京秀’和刺葡萄‘塘尾’中不同温度条件下的表达,发现在热胁迫条件下叶片中MBF1c的表达增加(图7a)。通过瞬时表达后荧光分析发现,在细胞质和细胞核中都检测到MBF1c-GFP(图7b)。在拟南芥原生质体中证实了MBF1c的转录活性。在研究HSFA2的转录活性时,效应器和报告器构建体如图所示(7c)。结果表明,MBF1c具有转录活性(图7d)。为了探讨MBF1c在葡萄耐热性中的作用,首先,在葡萄悬浮细胞中稳定表达重组蛋白MBF1c-GFP,与对照细胞(EV)相比,MBF1c在OE-MBF1c细胞中的表达高出约2倍(图7e)。当OE-MBF1c悬浮细胞在25°C下生长时,其外观与EV葡萄悬浮细胞相似;然而,在45°C热处理90分钟并在25°C下恢复7天后,更多的OE-MBF1c悬浮细胞仍优于EV悬浮细胞(图7f)。热处理和恢复后,对照和OE-MBF1c悬浮细胞的鲜重显著下降,但OE-MBF1c悬浮细胞的鲜重高于EV细胞(图7g)。

用CRISPR-Cas9基因编辑技术对葡萄悬浮细胞进行MBF1c突变,sgRNA如图所示(图8a)。通过测序检测葡萄悬浮细胞的突变体MBF1c,发现18个样本中10个样本被编辑,有6个类型突变(图8b),突变的氨基酸序列如图所示(图8c)。以上测序结果表明,MBF1c被成功编辑(图8b,c)。正如预期,当在25°C下生长时,mbf1c葡萄悬浮细胞的外观与EV细胞相似,然而,在45°C热处理85分钟并在25°C下恢复7天后,mbf1c悬浮细胞比EV细胞变的更黑(图8d)。同时,对照组和mbf1c细胞的鲜重显著下降,但mbf1c的鲜重低于EV细胞(图8e)。总之,这些结果表明MBF1c在葡萄的耐热性中起着重要作用。

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图7.MBF1c的表达、亚细胞定位、转录活性和功能

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图8.MBF1c基因的敲除降低了葡萄悬浮细胞的耐热性


04 研究结论

葡萄的耐热性受到HSFA2变异的调节,VdHSFA2比VvHSFA2具有更高的耐热性。VdHSFA2的转录激活活性高于VvHSFA2,VdHSVA2比VvHSVA2能够调节更多的靶基因。同时作者研究发现仅AHA1基序中的单个氨基酸(Thr315Ile)的变异导致VdHSFA2和VvHSFA2之间转录活性的差异。这一变异发现可能对理解植物耐热性和支持未来耐热葡萄的分子育种具有潜在意义。最后,MBF1c是HSFA2的靶基因,并在葡萄对热胁迫的反应中发挥相关作用。


文献链接:https://doi.org/10.1093/hr/uhac250


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