项目文章 | IF>9 转录组分析揭示稻瘟病菌致病性的调控机制

01  研究背景

水稻是世界上最重要的粮食作物，然而，每年因病虫害给水稻产量造成巨大的损失。在这些病害中，稻瘟病会严重影响水稻产量和质量，因此防治稻瘟病是保障粮食供应的关键。目前，利用抗病植物品种是预防和控制该病发生的最常用方法。然而，随着植物品种作物单一栽培的普遍做法以及病原菌生理小种的动态遗传和表观遗传变化，植物品种对病原菌的耐药性丧失是一个持续存在的问题和威胁。

蛋白激酶CK2是植物、动物和真菌必需的高表达蛋白，影响脂肪酸相关代谢和线粒体蛋白，使其对启动有效的先天免疫反应和植物致病性的能力至关重要。因此，增加对稻瘟病菌致病性机制的认识，是实现预防、限制危害和阻止具有破坏性后果的疾病流行的另一条重要道路。

02  材料与方法

研究材料：稻瘟病菌（用b1表示MoCKb1的缺失突变体，用b2表示MoCKb2的缺失突变体）

研究策略：RNA-seq

03  研究思路 

03  研究结果

1. CKb缺失引起的基因表达变化

为了研究CKb缺失引起的基因表达变化，作者对b1、 b2突变体和背景菌株进行RNA-seq鉴定。结果鉴定出b1突变体与背景菌株Ku80相比有1297个差异上调基因和1025个差异下调基因。接下来，为了了解b1和b2突变体与背景菌株Ku80之间DEGs的功能，作者利用KEGG和GO分析对DEGs进行分析。结果表明，蛋白激酶MoCK2中b1和b2成分的缺失影响了细胞代谢。差异基因上调或下调在细胞碳水化合物代谢、脂质代谢、蛋白质(氨基酸)代谢和次生代谢中显著富集（图1）。其中，b1突变体中上调和下调的DEGs有GO注释的基因分别为482和552个，而b2突变体分别有506和395个GO注释的DEGs。综合KEGG和GO的分析，结果表明，蛋白激酶MoCK2在稻瘟病菌的生长和发育中起着至关重要的作用，MoCK2成分的缺失会影响关键的代谢过程，从而导致之前观察到的明显表型缺陷（图2）。

图1. 与背景菌株Ku80比较，b1和b2突变体中DEGs的KEGG富集分析的部分结果

图2. 与背景菌株Ku80比较，b1和b2突变体DEGs中GO富集分析的部分结果

2. 乙酰辅酶A的合成在缺失突变体中受到影响

乙酰辅酶A在细胞中的主要来源是碳水化合物的分解代谢。为了确定MoCK2是否会影响乙酰辅酶A代谢，作者对乙酰辅酶A代谢相关基因表达进行了研究。首先，作者在两个突变体中检测到标注为属于碳水化合物代谢的基因。结果表明，MoCK2成分的缺失可能严重影响细胞的碳水化合物代谢。其中，参与碳水化合物分解代谢的基因主要在两个GO项中富集:细胞碳分解过程和碳分解过程 (图3A-D)。在GO:0044275和GO:0016052中显著富集的两个突变体中，上调的DEGs数量为74个，显著富集的下调的DEGs数量为66个 (图4E和F)。一些碳水化合物代谢中的酶，如内切葡聚糖酶和糖苷水解酶，在细胞中有许多编码基因。它们的表达变化也呈现不同的趋势，有的表达上调，有的表达下调，说明CK2参与碳水化合物代谢的复杂性。

此外，编码纤维素酶的上调基因MGG_10423和编码淀粉酶的下调基因MGG_03287表明MoCK2对稻瘟病菌多糖的分解代谢具有多种调控机制。此外，一些糖转运蛋白，如高亲和力葡萄糖转运蛋白、己糖转运蛋白和糖转运蛋白STL1在两种突变体中均有下调的趋势，这说明MoCK2的缺失影响了糖的吸收和转运，导致糖代谢特别是分解代谢相关基因的表达发生显著变化(图3G, H, T)。

葡萄糖通过糖酵解和线粒体导入转化为丙酮酸。线粒体中的丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶开始的一系列反应转化为乙酰辅酶A。因此，作者在b1和b2突变体中检测线粒体丙酮酸脱氢酶编码基因的表达和以下反应是否受到影响。结果显示，在b1和b2突变体中，线粒体丙酮酸脱氢酶代谢基因中有11个下调的DEGs显著富集(图4A~C)。作者还发现丙酮酸跨膜转运基因的表达在b1突变体中也呈现下降趋势，说明MoCK2的缺失也会影响胞质与线粒体或过氧化物酶体之间的丙酮酸跨膜转运(图4D)。上述结果表明，MoCK2的缺失影响了丙酮酸转化为乙酰辅酶A，影响了下游代谢。

上述结果表明，蛋白激酶MoCK2的缺失降低了细胞内碳水化合物的分解代谢和丙酮酸脱氢酶的活性，进而降低了乙酰辅酶A的含量，从而减慢了细胞的代谢，这可能是两个突变体表型缺陷的根本原因。

3. 在缺失突变体中，脂肪酸代谢对乙酰辅酶A合成的影响

上节讲到碳水化合物的代谢对乙酰辅酶A合成的影响，本节将会继续从脂肪酸分解代谢的角度探究其对乙酰辅酶A合成的影响。尤其是在分生孢子中 (图6A)，β-氧化是乙酰辅酶A合成的重要来源，作者也在其中检测到相关基因的表达变化(图5 b和C)。结果显示，b2突变体中42个下调基因和b1突变体中38个下调基因在脂肪酸分解代谢过程中富集(GO:0009062)(图5d和E)。进一步的分析表明,两个关键酶MGG_06918编码的肉碱乙酰转移酶和MGG_03418编码的酰基辅酶A脱氢酶在这两个缺失突变体中均被下调。在这其中肉碱乙酰转移酶和酰基辅酶A脱氢酶的表达降低可能会影响脂肪酸的氧化降解，降低乙酰基辅酶A在细胞中的含量，影响能量转换代谢进而影响细胞的合成代谢过程。此外，转运蛋白编码基因表达量的减少说明蛋白激酶MoCK2的缺失减少了细胞内脂肪酸的跨膜转运，而这种转运可以直接影响脂肪酸的氧化速率。总之，MoCK2的缺失可能通过减少脂肪酸代谢和细胞内运输来影响乙酰辅酶A的生成。

图5. b1和b2突变体脂肪酸代谢相关基因表达分析

4.在缺失突变体中，氨基酸代谢对乙酰辅酶A合成的影响

图6. 参与氨基酸分解代谢途径的基因表达

5.在缺失突变体中，转运蛋白编码基因的表达受到影响

在突变体的上调和下调基因中发现了调控氨基酸转运蛋白的基因。结果显示，编码氨基酸转运蛋白的MGG_08426、MGG_14203和MGG_05833表达在两种突变体中均被下调。此外，编码氨基酸含量的基因MGG_11327和MGG_06036在b1突变体中表达上调，编码脯氨酸含量的基因MGG_08548在b2突变体中表现为上调。这些结果表明，氨基酸转运蛋白对CK2缺失的响应具有复杂的调控作用。

6.已知与CKa直接相互作用的基因在CKb突变中上调

图7. b1和b2突变体中转运蛋白基因的表达图谱

05  总 结

在本研究中，转录组测序显示，稻瘟病菌蛋白激酶MoCK2的缺失严重影响细胞代谢，减少乙酰辅酶A的产生。与背景菌株Ku80相比，b1和b2突变体中涉及碳水化合物代谢、脂肪酸代谢和氨基酸代谢的基因表达下调，从而可能影响乙酰辅酶A的产生，严重影响能量和底物代谢过程，导致缺失突变体出现表型缺陷。在之前的pull down研究中发现的编码蛋白质与CKa相互作用的几个基因被上调。这种代偿性上调表明CKb1和-2在真菌生长和发病的许多方面都很重要。因此，后续的实验将进一步关注MoCK2如何在水稻的生理变化和致病性过程中影响核定位蛋白，以期对MoCK2有更深入的了解。