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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),位于武汉高农生物园,办公面积逾3000m2,是一家专业提供单细胞与空间组学测序分析、表观组学科研服务和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。

公司旨在为客户提供最专业的科研服务,运营至今合作的科研客户近千家,涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业,运营至今销售额超1亿元,科研成果曾多次在Cancer Cell、Plant Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL等国际高水平学术期刊发表,受到了客户广泛好评,是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。

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项目文章|WGBS、ChIP-seq和RNA-seq的综合分析构建青稞的调控元件景观和基因调控网络


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题    目:Inferring regulatory element landscapes and gene regulatory networks from integrated analysis in eight hulless barley varieties under abiotic stress

发表日期:2022年12月23日

发表期刊:BMC Genomics

影响因子:4.547

实验方法:WGBS-seq、ChIP-seq、RNA-seq等

2022年12月23日西藏农牧业科学院农业研究所青稞、牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室王玉林团队在期刊BMC Genomics(IF:4.547)发表题为“Inferring regulatory element landscapes and gene regulatory networks from integrated analysis in eight hulless barley varieties under abiotic stress”的研究论文。该研究利用WGBS、ChIP-seq和RNA-seq技术构建不同大麦品种在4种非生物胁迫下的表观调控景观,为青稞胁迫响应提供了很多数据资源。爱基百客为该研究提供WGBS和ChIP-seq的技术支持

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大麦是世界上种植的主要谷物之一,也是最古老的驯化作物之一。几千年来,青稞一直是中国藏族人的主食。目前类似于DNA元素百科全书(ENCODE)的项目已经出现,其目标是通过生成染色质可及性、TF占比率、蛋白质和DNA修饰以及基因表达的时空图来注释给定物种的非编码功能基因组。青稞ENCODE的可用性将有助于促进新观点的产生、跨物种比较、基因组注释和对植物进化过程中表观基因组功能的理解。

在本研究中,作者使用WGBS检测了低甲基化区域(LMRs);并结合ChIP-seq技术在耐受和易受胁迫的品种的LMRs中检测到不同的组蛋白修饰(H3K4me3和H3K27me3)数据,得出青稞基因组的调控景观,以及当比较胁迫下的耐受和易感品种差异修饰的增强子,还有增强子和靶基因之间的联系和参与应激反应的基因调控网络。




研究结果





1、青稞中低甲基化区域LMRs的全基因组鉴定

为研究青稞在非生物胁迫下的相关调控元件,作者构建了八个全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)文库用于全基因组鉴定与增强子相关的LMRs。作者研究的非生物胁迫包括干旱、盐度、寒冷和低氮。使用Illumina Hiseq X Ten对文库进行测序。每个文库的亚硫酸氢钠转化率为99%。共鉴定了231440个LMRs,每个样本平均鉴定了73249个LMRs。八个青稞品种在四种胁迫条件下的LMRs分布是一致的,其中LMRs主要以与基因密度分布相似的频率分布在染色体末端(图1)。


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图1 LMRs和组蛋白修饰的全基因组分布


2、LMRs中的组蛋白修饰


为探索LMRs在基因组上的位置分布,发现75%的LMRs位于基因组的基因间区域(图2a);ChIP-seq数据结果显示H3K4me3修饰有37000个峰;而在H3K27me3修饰的情况下检测到43000个峰。两组数据联合分析发现与H3K27me3峰相交的LMRs数量比与H3K4me3峰相交的数量高7倍(图2B)。结果与小鼠的LMRs一致。H3K27me3标记近端和远端调控元件,而H3K4me3主要出现在转录起始位点。

由于增强子可以在远处或两者中发挥作用方向,很难确定增强子的靶基因。为了鉴定受远端调控元件调控的靶基因,作者分别使用来自每个远端调控元件的10个上游和下游基因的表达数据(RNA-seq)。根据LMRs DNA甲基化水平和基因表达水平之间的相关系数筛选了20个基因。被增强子正向调节的基因应该表现出显著的负相关。使用该方法,作者鉴定了97909个增强子-基因对,其中56867个增强子和23367个靶基因。56867个增强子中有746845个TFBS,平均一个增强子有13个转录因子结合位点(TFBS)。每个增强子平均与1.7个基因相关,每个基因平均与4.2个增强子相关。在这些增强子基因对中,4468对增强子基因的靶基因是转录因子,约1116个转录因子。

为了研究推定的增强子和连接的靶基因之间的关系,作者使用50kb的窗口大小确定了识别的增强子-基因对之间的特定距离及其频率(图2C)。结果显示大约24%的增强子-基因对在150kb范围内,大约76%的增强子基因对跨越200kb或更大的基因组距离,中值距离为394kb。然后,作者选择了增强子-基因对(其中单个增强子与单个基因连接),并确定了连接的基因与最近的TSS对应的频率。大约59%的增强子只有一个推定的靶基因。只有5%的这些推定增强子-基因对是最接近的TSS。

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图2 LMRs和增强子基因相互作用对


3、非生物胁迫下转录因子的分析

使用iTAK工具在青稞基因组中总共鉴定了2329个转录因子,主要是B3、NAC、bHLH家族(图3A)。LMRs与含有转录因子结合位点的增强子相关,增强子招募转录因子以调节附近基因的表达。为了确定可能在建立和维持细胞命运以及适应极端环境中发挥重要作用的特定转录因子,作者首先确定了4个耐受品种的特定低甲基化LMRs中似乎过度表达的序列motif(图3B)。通过对LMRs内的重复掩蔽序列进行HOMER分析来实现该鉴定。在干旱胁迫下,鉴定出52个富含motif的相关转录因子,包括NAC、bHLH、MYB、TCP和bZIP。在冷胁迫下,鉴定出67个富含motif的相关转录因子,包括EBF、MYB相关、NAC、AP2、bHLH、TCP和bZIP。在盐胁迫下,鉴定出136个富含motif 的相关转录因子,包括TCP、MYB、NAC和bZIP。有文献已确定该因子与干旱胁迫相关。与DQ相比,XL16样本中有3156个显著上调的基因,包含181个转录因子。与DQ相比,XL16中有639个低DMR,215个低DMRs与LMR重叠。根据研究中确定的增强子基因对,靶基因由转录因子bHLH、TCP、bZIP、YABBY组成。此外,bHLH转录因子可以调控TCP、bZIP、YABBY转录因子。bHLH、TCP、bZIP转录因子也可能调控自身的表达(图3D)。


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图3非生物胁迫下转录因子的分析


4、LMR中分布的更自然的变化

为了确定自然变异模式,作者使用了先前发布的数据集的变异信息。用VCFtools过滤后,2200万个SNP用于后续分析。LMRs(相当于75.8Mb的序列)被发现含有911187个SNPs,每kb序列有12个SNPs;而整个基因组的频率平均只有每kb 6个SNPs。




研究结论



作者通过亚硫酸氢盐全基因组测序初步鉴定了青稞中的顺式调控元件。共鉴定了231440个低甲基化区域。通过与表达数据的相关性,发现了97909个所有LMRs的增强子基因对;并基于CREs中TFBS的特征推断转录因子的调控网络。结合H3K27me3修饰数据表明,许多LMRs在特定的非生物胁迫下被抑制。还在本研究中确定的顺式调控元件群体样本中包含许多单核苷酸多态性。整篇文献整合了WGBS-seq、ChIP-seq和RNA-seq的数据,构建了青稞增强子与启动子的关系对,并通过多组学数据解释了青稞的表观调控景观,为后续研究提供了数据支持。


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