BMC Plant Biol｜DAP-seq和RNA-seq揭示转录因子ZmCCT调节玉米光周期依赖性开花和胁迫响应

题目：ZmCCT regulates photoperiod-dependent flowering and response to stresses in maize

期刊：BMC Plant Biology

材料：WT植株和OE-ZmCCT植株

方法：RNA-seq、DAP-seq、EMSA、双荧光素酶报告实验、RT-PCR（爱基百客均可提供）

1. LD条件下，开花时间和抗旱性的表型变化

在LD（长日照）条件下，与WT植株相比，T₂代的转基因植株表现出延迟开花5-9天。在 SD 条件下，OE- ZmCCT的开花时间与 WT没有观察到显著差异（图1a，b）。在 LD 条件下，OE- ZmCCT的总叶数 (TLN)高于 WT（图1c）。这些结果表明在LD条件下，过表达ZmCCT会延迟玉米开花。此外，在LD条件下，OE- ZmCCT和WT植物对干旱胁迫的响应表现出显著差异（图1d）。在干旱胁迫处理后，OE- ZmCCT植株的 RWC（相对含水量）显著高于 WT植株（图1e）。这些结果表明ZmCCT在 LD 条件下具有调节玉米开花时间和胁迫响应的双重功能。

图1.ZmCCT对开花时间及胁迫响应的表型评价

为了了解ZmCCT响应光周期介导的开花过程中的调控网络，在SD（短日照） 和 LD 条件下，使用从野生型（WT）和ZmCCT过表达植株（OE- ZmCCT）的V6 生长阶段的叶子中提取的总RNA进行RNA-Seq。在 SD 和 LD 条件下分别鉴定出91和 746 个差异基因（图 2a）。在 LD 条件下有599个差异基因被注释到功能（图2a，b），这些基因的GO富集分析表明，它们主要参与细胞过程、对刺激的响应、代谢过程、生物调节、发育过程以及花发育。最重要的子类别是“对非生物刺激的响应”。其他有趣的重要子类别是“对刺激的响应”和“花朵发育”。热图显示 LD 条件下 WT 和 OE- ZmCCT之间的一些差异表达基因（图2c）。

为了研究ZmCCT是否可以作为基因表达的启动子或抑制子，在酵母中进行ZmCCT反式激活分析，它表现出明显的转录激活活性（图 3a）。然而，ZmCCT编码一种 CCT 结构域蛋白（图3b ），据报道该蛋白具有转录抑制活性 [ 21、29 ]。为了证实这一点，利用Gal4-LexA/UAS系统分析该蛋白质的正或负转录潜能。ZmCCT显著降低了报告基因的表达（图3c），表明ZmCCT具有转录抑制活性。总之，ZmCCT可能同时具有转录激活和抑制活性。

通过DAP-Seq 实验鉴定ZmCCT直接调控的潜在靶基因。DAP-Seq分析结果中共有 15,862 个peak峰，与两个motif显著相关，即 AAATGGTC 和 CAAAAATC（图 4a）（p-值 < 0.05)。通过EMSA实验验证了 ZmCCT 蛋白与 AAATGGTC 和 CAAAAATC 基序的特异性结合（图4d）。所有检测到的峰中，大约 21%位于基因区域，包括启动子、5'UTR、3'UTR、内含子和外显子（图4b）。peak峰关联的基因GO富集分析表明，这些基因在对刺激的响应和花发育子类中有显著富集（图4c）。在这些基因中，ZmCCT可能与1602个基因的启动子区域结合，这些基因主要参与细胞过程、细胞器组织、花发育、转录因子活性和对刺激的响应。    

为了进一步验证这些基因作为ZmCCT直接调控的特定靶标的表达水平，作者分析了在 LD 条件下WT 和 OE-ZmCCT的差异基因与上游区域ZmCCT直接调控的靶基因之间的重叠基因。确定了可能与开花时间调节、胁迫响应和花发育有关的21个差异基因。在这21个基因中，11个基因在OE- ZmCCT植物中上调，而其余10个基因下调。

DAP-Seq和RNA-Seq联合分析确定了10个与调控开花相关的ZmCCT潜在靶基因。为了研究ZmCCT是否可以调控这些潜在靶基因的表达，在烟草叶片中进行了双荧光素酶瞬时转录活性测定（Dual-LUC）。35S:: ZmCCT作为效应子，LUC（萤火虫荧光素酶编码基因）由潜在靶基因的不同启动子区域（- 3000 至 - 100 bp）驱动作为报告基因（图 5a）。结果表明，ZmCCT蛋白促进10个靶基因中3个的表达，同时抑制其余7个基因的表达（图5b）。特别地，ZmCCT与ZmPRR5（- 1567 bp）、ZmRVE6（- 420 bp）和ZmCOL9 （- 1315 bp）的启动子结合以促进ZmRVE6的表达，并抑制ZmPRR5和ZmCOL9的表达（图5b)。

RNA-Seq 结果显示对生物和非生物胁迫的响应相关的9个基因有差异表达，其中6个基因在OE-ZmCCT中上调，3个基因下调。Dual-LUC测定结果证实了 RNA-Seq 的结果（图5b、6a）。这9个基因中的4个，即ZmVOZ1 、ZmARR16、ZmHY5和ZmMPK3，已知与干旱胁迫反应有关。结果进一步表明，ZmCCT与ZmVOZ1和ZmARR16启动子结合抑制其表达，与ZmHY5和ZmMPK3启动子结合促进其表达（图5b，6a)。

为了进一步证实这一点，检测了在LD条件下充分灌溉和干旱胁迫处理的WT 和 OE- ZmCCT植株中这9个基因的mRNA水平。RT-qPCR结果表明，干旱胁迫下，ZmHY5和ZmMPK3在 OE –ZmCCT和WT 植株中的表达量均上调，且在OE-ZmCCT植株的表达量明显高于WT植株（图6b）。与此同时，在干旱胁迫诱导后， ZmVOZ1和ZmARR16在OE- ZmCCT和WT植株中均被下调，且在OE-ZmCCT植株中表达量明显低于WT植株（图6b）。其余5个基因的表达水平在充分灌溉和干旱胁迫处理之间没有显著差异（图6b）。这些结果表明ZmCCT主要通过直接调控这4种干旱胁迫相关基因（ ZmHY5、ZmMPK3、ZmVOZ1和ZmARR16）的表达来响应干旱胁迫。

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