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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),位于武汉高农生物园,办公面积逾3000m2,是一家专业提供单细胞与空间组学测序分析、表观组学科研服务和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。

公司旨在为客户提供最专业的科研服务,运营至今合作的科研客户近千家,涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业,运营至今销售额超1亿元,科研成果曾多次在Cancer Cell、Plant Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL等国际高水平学术期刊发表,受到了客户广泛好评,是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。

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New Phytol | 野生烟草花冠细胞的单细胞RNA测序揭示花香的生物合成途径

近几年,基于单细胞技术的发展,单细胞转录组学已经越来越多应用到植物上,主要应用方向有表征组织中细胞转录组图谱、识别稀有细胞类型、重建发育过程中的细谱系、比较胁迫和非胁迫下的细胞反应等,主要应用的器官有拟南芥的叶、根;玉米的叶、根;杨树的茎;水稻的根、叶片等;但应用于花且研究花香的很少。今天给大家带来一篇发表在New Phytologist的野生烟草花冠细胞的花香的生物合成途径的单细胞文章;该文结合了10x Genomics与GC–MS等技术,希望给大家带新的视角。

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题    目:Single-cell RNA-sequencing of Nicotiana attenuata corolla cells reveals the biosynthetic pathway of a floral scent

发表日期:2022年1月

发表期刊:New Phytologist

影响因子:10.323

实验方法:10x Genomics  GC–MS

NO1

研究背景


花朵产生不同的挥发物,用于各种生态相互作用。已经鉴定出1700多种不同的花香,根据它们的生物合成途径,这些气味被分类为萜类、脂肪酸衍生物和苯丙烷类/苯类。花香多样性的一个分子机制是生物合成基因的伴随突变的复制事件(新功能化)。编码区的突变可以通过与原始底物或类似底物结合产生新的挥发性化合物。花香主要在花瓣中合成。例如(S)-芳樟醇合酶和异丁香酚O-甲基转移酶在啤酒花中产生。

目前单细胞技术将产生气味的细胞与整个花瓣中的其他细胞分离可以提高共表达分析的准确性。为确定这种罕见花香的整个生物合成途径,作者对从野生烟草花冠四肢和喉杯分离的原生质体进行了scRNA-Seq,并根据基因表达的细胞间变异定义了不同的细胞簇。利用scRNA-Seq数据集进行基因共表达分析,并对酶活性进行体内和体外表征,以此来鉴定整个BA生物合成相关基因。

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技术路线


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NO3

研究结果


1、单细胞RNA测序确定了花冠中不同的细胞类型

为了生成参与BA生物合成的基因的单细胞转录组图谱,作者在BA排放增加时三个时间点(ZT 8、ZT 12和ZT 16)从野生烟草的花冠肢和咽杯中分离原生质体(图1a)。然后进行单细胞测序,并将这些数据集与RNA-Seq数据集进行比较。两个数据集的全局转录组图谱高度相关。在单细胞群体中,检测到82-87%的基因,这些基因在批量RNA-Seq分析中被检测到。在所有时间点总共检测到16465个基因用于进一步分析。

作者将剩下的主要簇分为三组细胞:表皮、绿色组织和薄壁组织。已知表皮细胞表达用于合成角质蜡和角质的蜡/角质生物合成基因。参与角质层蜡生物合成的几个基因在簇0、3、4、5和9中特异性富集:酮酰基辅酶A合成酶、ECERIFERUM4、蜡酯合成酶/二酰基甘油酰基转移酶1和几个可能参与蜡合成或运输的脂质转移蛋白被高度表达(图1d)。还发现,与其他簇相比,簇0、3、4、5和9含有更高水平的角质生物合成基因(甘油-3-磷酸酰基转移酶6和角质合酶样);它们的蛋白质序列与已充分研究的拟南芥直向同源物相似。这些结果表明簇0、3、4、5和9是表皮细胞。簇6被认为是一种氯间充质细胞,因为它含有高表达的光系统I和II的复杂亚基(图1e)。如图1(a)所示,花冠的喉杯保留了叶绿体。众所周知,光合作用基因具有明确的昼夜节律,白天高水平,晚上低水平。作者的scRNA-Seq数据显示,几个光合基因的转录水平从ZT 8(中午)逐渐降低到ZT 16(反映了从光到暗的过渡时间)(图1e)。簇1和簇2具有低水平的角质层生物合成基因和相对高水平的光合基因。这些结果表明,在花冠中,簇1和簇2是薄壁细胞。

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图1. 单细胞RNA测序(scRNA-Seq)表征不同的烟草花冠细胞类型

2、单细胞水平的相关性分析优先选择苄基丙酮生物合成的候选基因

在花冠中,BA生物合成的初始步骤是通过NaPAL4的作用对Phe进行非氧化性脱氨作用(图2a)。NaPAL4酶的产物,叔肉桂酸,很可能在没有进一步羟基化的情况下被4-香豆素酸:辅酶a连接酶(4CL)或肉桂酸:辅酶a连接酶的同源蛋白转化为肉桂酰基辅酶a,因为BA在芳环上没有羟基。作者假设肉桂酰辅酶a可能与一分子丙二酰辅酶a缩合,从而产生苯半乳糖酮(4-苯基-3-丁烯-2-酮),这是苯基丁酮的C6–C4部分。不确定一种或一些NaPKS是否有助于将肉桂酰辅酶A转化为苄半乳糖酮。最后,苄半乳糖酮似乎被一种未知的还原酶还原,从而产生BA。

为了鉴定BA生物合成基因,作者假设所有BA生物合成基因都会随着时间的推移在单细胞水平上共同调节。由于已知NaPAL4是BA生物合成的第一种酶,作者计算了scRNA-Seq数据中检测到的NaPAL4表达与全基因表达的相关系数;还在20个已发表的批量RNA-Seq数据集中计算了相同的基因间相关性,这些数据集来自种子、叶、根、茎、花药、花柱、柱头、卵巢、蜜腺、蒂和花冠的组织。作者通过比较了两个数据集中排名前40位的基因与NaPAL4之间的功能关系(图2b)发现在scRNA-Seq(40个基因中有13个)中检测到的参与苯丙素代谢的基因比在批量RNA-Seq(40个基因组中有6个)中更多。

接下来,作者根据与NaPAL4的相关性,对scRNA-Seq数据中的候选基因——CoA连接酶、PKS和还原酶进行了优先排序。scRNA-Seq和批量RNA-Seq数据中排名前40位的基因包含一个常见的4CL/CNL样基因(Na4CL1,A4A49_40482),表明Na4CL1是产生BA的最强候选酶。在四个NaPKS中,NaPKS2是scRNASeq数据集中排名最高的基因,其次是NaPKS3(图2c)。然而,在批量RNA-Seq数据集中,NaPKS3与NaPAL4的相关性大于NaPKS2(图2c)。在scRNA-Seq和bulkRNA-Seq数据集中发现了2-烯醛还原酶(AER)的五个同源物和另一个还原酶家族异黄酮还原酶(IFR)的四个同源物,并发现一种推定的AER(NaAER1,A4A49_31470)在scRNA-Seq中排名很高(图2b,c)。在批量RNA-Seq中,与NaAER1相比,所有IFR基因和五个AER同源物中的三个与NaPAL4表达的相关性更高(图2c)。相关系数在scRNA-Seq中的分布与其在体RNA-Seq的分布不同。scRNA-Seq中的大量基因似乎与NaPAL4的相关性较低。

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图2.通过单细胞水平的相关性分析鉴定苄基丙酮(BA)生物合成基因

3、Na4CL1、NaPKS2和NaAER1参与苄基丙酮的生物合成

scRNA-Seq数据集中共表达分析产生的BA生物合成模型(图2a),通过VIGS沉默Na4CL1的表达,并测量顶部空间和内源性细胞中的花挥发物水平。发现沉默Na4CL1降低了花顶部空间中BA的水平(图3a)和内源性细胞中BA的含量(图3b)。值得注意的是,在烟草花中表达的其他Na4CL1同源物(A4A49_41306和A4A49_10638)和NaCNL同源物(A4 A49_13610和A4A49k_12688)在Na4CL1沉默的花冠中没有被沉默。

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图3野生烟草4-香豆素酸盐:辅酶A连接酶(Na4CL1)参与衰减烟草花中苄基丙酮(BA)的生物合成。


为了评估Na4CL1的催化能力,在相同的条件下,用叔肉桂酸和几种C6–C3化合物(4-苦杏仁酸、咖啡酸和阿魏酸)测试纯化的Na4CL1蛋白(图3c)。Na4CL1显示出催化叔肉桂酸和类似C6–C3化合物的CoA硫代酯形成的能力。测定结果表明,Na4CL1对叔肉桂酸和4-香豆素酸的亲和力高于对咖啡酸和阿魏酸的亲和力。尽管作者将VIGS构建体设计为尽可能特异,但在NaPKS之间观察到的高序列相似性可能导致NaPKS1/2/3/4被沉默(图4a)。结果表明沉默NaPKSs降低了顶部空间和花冠肢中BA的水平(图4a、4b)。

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图4烟草聚酮合酶2(NaPKS2)是一种参与烟草花中苄基丙酮(BA)生物合成的酶

尽管NaPKS2和NaPKS3都在花组织中高水平表达,scRNA-Seq数据集表明NaPAL4与NaPKS2的相关性高于与NaPKS3的相关性;NaPAL4和NaPKS2主要在簇0、3和4中表达,但NaPKS3在整个簇中表达(图6)。当作者将相同量的纯化NaPKS2或NaPKS3蛋白与Na4CL1产物(肉桂酰基CoA)和丙二酰基CoA(作为碳供体)孵育时,作者在含有NaPKS2的混合物中检测到苄半乳糖酮,但在含有NaPKS3的混合物中没有检测到(图4c)。结果表明,正如scRNA-Seq相关性分析预测的那样,NaPKS2可能在BA生物合成中发挥主要作用(图2c)。

通过VIGS沉默了候选还原酶NaAER1,并测量了顶部空间和内源性细胞中花挥发物的水平。沉默NaAER1在不沉默其他同源物的情况下损害了花冠中BA的生物合成;NaAER1沉默的花中BA排放和内源BA的水平降低(图5a、b)。作者检测到一种从NaAER1沉默的花中释放的新化合物,该化合物在对照花的顶部空间中不存在(图5c)。代谢物裂解模式和标准化合物注射验证了该化合物是苯半乳糖酮,BA的非还原形式。NaAER1蛋白的动力学分析表明,苯半乳糖醇的KM值低于其他具有羟基或甲氧基的衍生物(图5d)。

此外,GC–MS证实,用NADPH(一种生物还原剂)纯化的NaAER1蛋白可以将苄半乳糖酮转化为BA。苯半乳糖酮在NaAER1沉默的花冠中的积累和体外测定表明,NaAER1是参与BA生物合成的最终酶。

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图5烟草2-烯醛还原酶1(NaAER1)是催化苄基丙酮(BA)生物合成的最终酶

4、苄基丙酮是在表皮层合成的

在3756个细胞中,1648个含有至少一分子NaPAL4信使RNA(mRNA)。假设80%的NaPAL4表达细胞属于表皮细胞(簇0、3和4),作者假设BA是在花冠的表皮层合成的。并计算了携带单个基因或NaPAL4、Na4CL1、NaPKS2、a n d NaAER1基因组合的细胞数量。在3756个细胞中,1097个包含所有四个基因;94%的这些细胞在簇0、3和4(表皮细胞)中发现(图6a)。大多数表达NaPAL4的细胞(67%)包含所有三个基因:Na4CL1、NaPKS2和NaAER1。为了可视化两个靶基因共表达的细胞的空间分布,作者合并了NaPAL4的两个特征图和Na4CL1、NaPKS2和NaAER1表达中的一个(图6b)。结果表明,高水平的共表达(黄色细胞)主要在簇0中发现,这表明在表皮中发生了气味合成步骤。为验证BA生物合成细胞的定位,作者构建了NaPAL4启动子-GFP系和NaPKS2启动子-GRP系。在这两个品系中,在花冠表皮中,特别是在近轴区,强烈检测到GFP表达(图S20),这表明簇0、3和4是表皮细胞。Phe生物合成基因主要在簇0、3和4中检测到,但这些基因也在其他簇(簇1和2)中表达(图6c)。点图还显示NaPAL2/3/4与Na4CL1、NaPKS2和NaAER1在表皮细胞中高度表达(图6c)。

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图6苄基丙酮(BA)生物合成细胞簇的表征。

5、苄基丙酮(BA)生物合成基因的昼夜节律与BA排放

由于烟草花有节奏地释放BA,作者猜测是否所有BA生物合成基因都有这种昼夜表达模式。实验显示BA在ZT 12附近开始增加,并在ZT 16达到峰值(图7a)。定量PCR分析显示,NaPAL4、Na4CL1、NaPKS2和NaAER1的转录水平在BA释放水平达到峰值前约4小时达到峰值,表明BA发射主要在转录水平上受到调节。scRNA-Seq数据也显示了BA生物合成基因的类似表达模式。例如,小提琴图显示了NaPAL4转录物在簇0、3和4中类似的时间依赖性表达(图7b)。每个簇中其他BA生物合成基因的转录水平也取决于时间,略有差异:Na4CL1和NaAER1在所有簇中的表达在ZT 12达到峰值,但NaPKS2的表达仅在表皮簇中从ZT 8增加到ZT 16(图7b)。

在矮牵牛花中,有节奏的气味释放受到几种转录激活因子的调节:矮牵牛属ODORANT1(PhODO1)和苯醚释放I/II(PhEOBI/II)。PhODO1在晚上达到峰值,正好在气味释放峰值之前。PhEOBII在早上达到峰值,并直接激活PhODO1和PhEOBI。在烟草基因组数据库中,作者鉴定了三种矮牵牛MYB转录因子的几种同源物。在这些同源物中发现PhODO1的一个同源物和PhEOBI/II的两个同源物在烟草花中表达。定量PCR分析显示,类NaODO1和类NaEOBI与BA生物合成基因同时达到峰值(ZT 12),类NaEOBII在白天达到峰值(图7a);在小提琴图谱中也观察到了这些变化(图7b)。单细胞RNA-Seq数据显示,NaODO1样表达而不是NaEOBI/II与NaPAL4具有高度相关性(图2b),并且仅限于簇0、1、2、3和4,这表明NaODO1-样调节BA生物合成基因。

接下来,作者测量了BA生物合成基因在花冠肢和管中的转录水平(图7c)。尽管NaPAL4在花冠肢中的转录水平与在花冠管中的水平没有差异,但Na4CL1在花冠管的表达低于在花冠肢。在花冠管中几乎没有检测到NaPKS2和NaAER1转录物,这与BA生物合成的已知位置一致。

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图7苄基丙酮(BA)生物合成基因的昼夜节律及其在花组织中的表达模式。


爱基小结

本研究使用单细胞转录组测序技术来揭示花挥发性物质的整个生物合成途径。野生烟草的花冠散发出一股香味,主要由苯丙酮(BA)组成。通过绘制烟草花冠细胞的单细胞转录图谱,对3,756个单细胞中大于16,000个基因的转录水平进行分析。研究者进行了非监督的聚类分析,以确定哪些细胞群参与了BA的生物合成。通过分析单细胞转录组测序数据集中的基因共表达和沉默花冠中的候选基因,揭示了BA的生物合成途径。总之,单细胞转录组测序技术提供的高分辨率基因表达时空图谱揭示了植物特定细胞类型代谢的分子特征。

文献链接:https://pan.baidu.com/s/1FzWQRgxSG5BYXpzok-9mKw?pwd=0ugf

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