零代码利用KofamKOALA进行在线版蛋白KEGG注释

不管是常规的转录组测序，还是富集实验测序。在拿到目标基因之后，都需要对基因进行注释（GO/KEGG/COG等）。此外，GO/KEGG富集分析也是用于后续深入分析的重要手段。为了进行富集分析，对基因的GO/KEGG注释是至关重要的。除了自建基因组以及少部分数据库会有开放的KEGG注释外，大部分开源的基因组都无法下载到此基因组对应基因已有的KEGG注释（尤其是非模式物种）。目前分析的主要方案都是利用eggNOG-mapper（我们也是使用这个分析），对基因组蛋白文件进行同源比对，随后调用eggNOG收录的KEGG注释。但也有不少老师认为这个软件对应的注释不全，希望寻找一个其他的注释方案。在此介绍一个KEGG官网推荐的注释网站KofamKOALA。这个网站和eggNOG一样，也可以用于在线分析，方便一些没有生信条件的老师使用。

数据库网址：https://www.genome.jp/tools/kofamkoala/

• 使用方法：

一、拿到基因组蛋白序列文件

以大豆基因组【Glycine max Wm82.a4.v1】为例。数据库里会有可供下载的pep.fa。注意一定是用蛋白序列，而不是基因序列！

二、序列拆分

在拿到蛋白序列文件后，除了使用本地版KofamKOALA外，在线版对于输入的蛋白序列数量有一定要求（<1w条）。但是一个基因组一般不会只有这么少的基因（小基因组物种除外），因此要先把完整的pep.fa进行拆分（比如使用TBTools）。

三、文件上传

• 注意：

  （1）邮箱必填，后续会用到。

  （2）HMM模型阈值，默认是0.01。可自行修改（eggNOG-mapper默认是0.001）

四、邮箱点击确认

在上传了蛋白序列，以及点击了【compute】后，页面会跳转并告知要求邮件确认。

查看邮件（没有的话看看垃圾箱），并点击【submit】对应的链接即可。然后就是等待结果交付（我这个大概是1w附近条序列，需等待2h左右）。

五、注释结果下载

默认输出结果是所有注释信息，可以通过点击【Above threshold】在线查看满足阈值的注释以及k号，然后也可以点击download进行本地文件下载（如果要用于后续富集分析，就点击【input file for Kegg Mapper】）。

六、和eggNOG-mapper的对比

（1）数量差异：

针对于同一个基因组的两种不同数据库注释，我们做了对比。结果显示2种数据库的注释数量不太一致（list1是KofamKOALA，list2是eggNOG-mapper）。

（2）特有差异

对拥有注释的蛋白取交集（29296）和并集（45599）发现两者具有较高的重叠，但也有一定的独特注释（加上KofamKOALA，相比单纯的eggNOG-mapper注释多了5k）。

（3）注释信息差异

两个数据库绝大多数蛋白都享有相同的k号，但也有少部分蛋白的注释不太一致（见红框），推测可能与数据库收录情况有关，鉴于这两者都是常用且被认可的数据库，私认为可以考虑并集整合。

此教程适配没有生信平台的老师，在线版有一定的限制，比如输入序列数量，只能进行单次分析等（除非你有多个邮箱能够接收结果）。有条件的老师还是可以考虑使用本地版进行注释，官网也是有本地kofam数据下载，感兴趣的老师可以自行去看看~