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项目文章 | Nature Commun&蓝藻转录因子PhoB对磷/铁的营养元素限制的调控机制近日,华中师范大学邱保胜教授团队在《Nature Communications》发表题为“Phosphorus deficiency alleviates iron limitation in Synechocystis cyanobacteria through direct PhoB-mediated gene regulation”文章,其重点研究了Synechocystis蓝藻转录因子PhoB在对于磷/铁的营养元素限制的调控机制,构建了这两种元素的同时发生变化的代谢调控网络。 1.研究背景 铁(Fe)和磷(P)作为所有生物体所需的必需养分,参与一系列生理生化反应及生物代谢过程。最近的研究表明铁和磷的限制会同时发生,在低纬度海洋和淡水生态系统的大片区域以及陆地土壤环境中都存在这种铁/磷的同时出现缺乏。然而,目前对于铁/磷共限制环境中的生物体的适应性研究相对较少,有其是此过程基因调控机制。 2.研究思路 3.研究背景 1. P缺乏缓解了Fe限制环境下蓝藻的生长缺陷 研究首先对Fe/P单独与同时缺乏培养条件下蓝藻6803的生长以及相应物质积累情况进行了观察。正如预期,单独的Fe缺乏(−Fe+P)会强烈阻碍蓝藻的生长(图1a-d)。然而,缺磷明显减轻了这种影响。蓝藻细胞在Fe/P共同缺乏的情况下比在仅Fe缺乏的生长快15%(图 1d)。培养4天后,-Fe-P条件下积累的生物量比-Fe+P条件下积累的生物量更多(图1c)。 同时,观察Fe限制诱导标志基因(isiA)和P限制诱导标志基因(pstS、pstS2)。在共限培养物观察到的叶绿素吸收光谱变化与IsiA基因表达情况一致(图1e)。-Fe-P处理的细胞光合性能显着高于-Fe+P(图1f)。总体而言,这些结果一致表明,P缺乏减轻了Fe缺乏情况下蓝藻的生长抑制。显微镜检查(图1g)和流式分析都表明在任何实验条件下细胞大小都没有显着变化,这意味着此种调控机制与细胞大小无关。 图1磷缺乏促进了铁限制蓝藻的生长 2. Fe-/P-条件下sod表达上调 先前的工作表明,-Fe/-P条件下ROS的大量积累会对蓝藻的光合活性产生严重影响。检测总ROS水平发现-Fe-P细胞的ROS含量比-Fe+P细胞降低了75%(图2a),表明缺铁条件下低磷诱导了ROS清除活性增强。qRT-PCR 分析表明,几个参与 ROS 清除的基因在-Fe−P条件下比-Fe+P条件下表达更高。在差异表达的基因中,含铁超氧化物歧化酶(SOD)编码基因sodB上调最多。进一步分析发现,+Fe−P和−Fe−P样品中sodB的表达显著上调(图2b),表明P缺乏增强了sodB的表达。使用凝胶内活性染色的 SOD 测定进一步支持了这个结论(图 2c、d)。蓝藻SOD 活性因 Fe 饥饿而急剧降低,而在 P 缺乏时则出现增加(图2d)。SOD的活性增强可能是Fe/P 联合集胞藻中 ROS积累减少的原因。 图2 在磷缺乏的情况下sodB 基因表达增强 3. 在海水中磷也同样调节对SOD表达变化 实验室环境下实验结果表明,在铁充足和缺乏的条件下,缺磷都会诱导 sodB 表达,因此作者检测海洋水体环境下蓝藻的 sod 基因表达否也随营养元素变化而变化。SOD 存在四种亚型,每种亚型具有不同的金属辅因子。只有sodB 使用Fe作为其蛋白结构辅因子。全球海洋 TARA 宏基因组数据集中 sod 的分布模式表明,sod 广泛存在于在不同水平的磷酸盐 (Pi)生物利用度下的物种之中 (图 3a)。宏转录组分析显示,不同sod亚型的表达在低Pi区域富集(图 3a)。考虑到海洋磷循环的复杂性,接下来对sods转录物与磷限制生物标志物pstS的相对水平,结果显示它们的丰度之间呈现正相关(图3b)。这些结果表明,海洋中缺磷会增强sods 的表达,这可能是蓝细菌的常见反应机制。 图3 sods在海洋生态系统中分布情况 4. 磷缺乏增强了铁限制下蓝藻的 O2− 抗性 为了探讨sod对铁限制蓝藻生长的影响,分别在存在和不存在甲基紫精(MV)的情况下进行了耐氧实验。如图4所示,Fe限制的蓝藻对O2− 胁迫高度敏感。与没有MV相比较,-Fe+P 样品的光合电子传输速率 (ETR) 在 O2−诱导剂存在下显着降低(图4a)。与 MV 一起孵育 8 天后,−Fe+P 样品的 ETR 几乎检测不到。相反,当缺磷与-Fe同时发生时,Fe限制细胞(-Fe-P)对O2−的抵抗力明显增强(图4a)。流式结果也观察到类似的结果(图 4b)。这些结果表明,缺磷可以进一步增强铁限制蓝藻的O2−耐受性。 图4 缺磷可以增强铁缺乏情况下蓝藻对O2−耐受性 5. 转录因子 PhoB 介导sodB 上调 为了探究在 Fe/P 共限制下诱导 sodB 表达的调控机制,使用酵母单杂交 (Y1H) 系统筛选sodB 启动子互作相关蛋白,OmpR 家族转录因子 PhoB 被确定为假定的调节因子(图 5a)。生信分析结果显示PhoB 结合基序位于sodB 的启动子区域,且凝胶电泳迁移实验EMSA结果也进一步证实 PhoB 和 sodB 启动子之间的互作关系(图 5b)。PhoB 是一种转录激活因子,已知可在低环境 Pi 浓度下控制磷相关基因的表达,但PhoB激活 SOD 基因表达的功能此前尚未得到确定。 为了评估PhoB在sodB基因表达中的调节作用,通过插入失活来敲除phoB基因。如图5c所示,在phoB突变体中sodB的表达显着降低。在-Fe-P条件下,野生型(WT)中sodB的转录水平增加了5.8倍,而在phoB 突变体中只有2.8倍的增加。phoB 突变体中残留的 sodB 诱导可能是由于转录因子 RpaB,它是氧化应激反应中已知的调节因子。且在 Y1H 文库筛选测定中也发现 RpaB 与 sodB 启动子存在相互作用。进一步分析发现,−Fe-P 情况下WT中的细胞内ROS含量仅为-Fe+P下的26%,而在phoB突变体中为80%(图5d)。sodB诱导的减少显着降低了−Fe-P的蓝细菌的MV耐受性(图5e)。O2−耐受性测定表明,当phoB被敲除时,磷缺乏不再能增强-Fe蓝细菌的O2−抵抗力,并且-Fe-P细胞表现出类似于-Fe+P细胞的反应(图5e)。作者在蓝藻细胞(SodB-OE 菌株)中过表达 sodB,以探索 sodB 在 ROS 稳态中的作用。考虑到 sodB 是 Fe 依赖性的,这种金属酶的高表达可能会增加细胞对 Fe 的需求,导致更严重的 Fe 缺乏和更缓慢的生长。总而言之,这些结果一致表明,PhoB 介导的 sodB 表达对于在−Fe−P 条件下维持 ROS 稳态至关重要。 图5 转录因子 PhoB 调控sodB表达 6. PhoB 调节 Fe 选择性孔蛋白的表达 通过Y1H(图6a)和EMSA测定(图6b)验证了PhoB和铁选择性孔蛋白slr1908启动子之间的特异性相互作用。qRT-PCR结果分析表明,在WT中,slr1908的转录水平受到磷缺乏的强烈诱导,在+Fe−P和−Fe−P条件下分别上调7.5倍和4.6倍(图6c)。然而,slr1908 的表达在 phoB 突变体中显着降低(图 6c)。由于slr1908 的完全敲除突变体不可用,因此在敲低(KD)突变体中评估了 slr1908 在 Fe/P 共限制下的生理作用。与WT相比,slr1908KD菌株的生长在-Fe+P条件下显著被抑制(图6d),这与该基因在Fe吸收中的重要作用相一致。与 Fe 限制条件相比,slr1908KD 菌株的生长在 Fe/P 共同限制下并未增强。−Fe−P的slr1908KD菌株的生长速率和细胞密度甚至低于-Fe+P条件下的生长速率和细胞密度(图6d)。此外,slr1908的过度表达显着提高了Fe限制蓝藻的生长速率,表明slr1908诱导在适应Fe限制中发挥着关键作用。鉴于PhoB在低磷反应中的重要作用,此次研究结果表明 PhoB 还促进Fe的吸收,并在Fe和P 稳态之间的串扰中发挥重要作用。 图6 PhoB调节slr1908表达 7. PhoB 还调节参与趋化性和外毒素分泌的基因 当 phoB 失活时,缺磷对铁限制生长的积极作用大大减弱(图7a),证实了PhoB 介导的转录调控在 Fe/P 共限制反应中的重要性。利用系统发育足迹分析对 PhoB 靶基因的启动子区域基序进行验证从而鉴定 PhoB 介导的全基因组基因调控,得到的该基序与之前报道的pho box共有序列一致,核心序列(TTAA)高度保守。EMSA 测定表明,这三个 TTAA 序列中任何一个的突变都会显着降低或消除 PhoB 的 DNA 结合能力,表明这三个串联重复序列对于 PhoB 的识别至关重要。 根据核心基序的序列,鉴定出211个启动子含有潜在的 PhoB 结合位点。其中,92个潜在靶基因在Fe充足或缺乏条件下因P缺乏而上调(FC≥1.5,P值≤0.05)。PhoB染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 结果进一步验证此结果,这92个基因中的60个在ChIP-seq 结果中得到富集。除了众所周知的控制磷酸盐同化作用外,新发现的PhoB 靶标还包括与应激反应、光合作用和四吡咯代谢相关的基因。其中有sll1552,该基因位于I型分泌系统编码基因slr1651的上游,方向相反,可能与下游酰基转移酶基因sll0720和RTX(毒素中重复)蛋白基因sll0721形成外毒素生物合成簇(图7b)。转录组数据(图 7c)和 qRT-PCR 分析表明,该簇中的所有基因均在缺磷的条件下表达升高。它们在phoB 突变体中的表达显着降低。通过EMSA实验进一步验证了PhoB与其启动子之间的相互作用(图7d)。此实验结果进一步支持了 PhoB 对 sll1291 簇的调节作用(图 7e)。 图7 转录因子PhoB调控趋化性和外毒素相关基因 本研究首先是对Fe/P单独与共缺乏培养条件下蓝藻的生长及生理相关指标进行检测,提出问题:P缺乏对于Fe缺乏的条件下蓝藻的抑制生长有一定的恢复,但是机制不明。接下来检测到细胞内ROS发现,发现-Fe-P细胞的ROS含量比-Fe+P细胞低,进一步考虑验证是对O2-的抵抗,锁定sodB (Fe作为其蛋白结构因子)为关键调节因子。酵母单杂Y1H筛选sodB 启动子互作相关蛋白为OmpR 家族转录因子 PhoB,进一步EMSA和ChIP-seq实验验证PhoB对sodB 启动子结合和调控,且PhoB还调节参与铁选择性孔蛋白slr1908表达,以及趋化性和外毒素分泌的基因,从而构建Fe/P共限制情况下调控网络模型(图8)。 图8 phoB介导的铁/磷共限调控网络模型 武汉爱基百客生物科技有限公司,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序和单细胞时空组学的新型生物科技服务企业。公司先后引入ChIP、WGBS、ATAC-seq、全转录组、DNBSEQ-T7、10xGenomics和SeekOne®DD等实验平台,不断提升公司的科研服务能力。运营至今合作的科研客户超2000家,涵盖国内知名科研院所、高校以及生物研究相关企业,科研成果曾多次在Science、Cancer Cell、Circulation、Nature Commun、Genome Biology和Plant Cell 等国际高水平学术期刊发表,受到客户的广泛好评。 项目咨询 了 解 更 多 { 往 期 精 彩 回 顾 } 精选合集,欢迎收藏哟! |