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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),位于武汉高农生物园,办公面积逾3000m2,是一家专业提供单细胞与空间组学测序分析、表观组学科研服务和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。

公司旨在为客户提供最专业的科研服务,运营至今合作的科研客户近千家,涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业,运营至今销售额超1亿元,科研成果曾多次在Cancer Cell、Plant Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL等国际高水平学术期刊发表,受到了客户广泛好评,是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。

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看不见的甲基化效应——甲基化检测技术助力解析表观遗传现象


一、为何看不见DNA序列改变,却能造成遗传差异?

DNA甲基化是一种独特的遗传调控机制,它在不改变基因组DNA的核苷酸序列的前提下,能够引起基因表达的遗传性变化。这一过程主要通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用,在胞嘧啶的5号碳原子上添加甲基基团来实现。这种表观遗传修饰在生物界中广泛存在,是一种既保守又可逆的调控方式。

在生物体内,DNA甲基化水平通过甲基化和去甲基化的动态平衡来维持。具体来说,DNA甲基化的过程可以细分为两种类型:一是从头甲基化,即在原本未甲基化的DNA位点上建立新的甲基化模式;二是维持甲基化,即在DNA复制过程中保持原有的甲基化模式。相应地,DNA去甲基化也分为两种形式:主动去甲基化,这是一种有意识的去甲基化过程,涉及特定的酶来移除甲基基团;被动去甲基化则通常发生在细胞分裂过程中,由于DNA复制后新合成的链未能及时甲基化,导致甲基化水平的自然下降。

这四种关键的甲基化和去甲基化过程,均由一系列特定的酶来催化完成,它们共同参与调控基因的表达,影响细胞命运和生物体的发育。

01
植物DNA甲基化机制

植物建立甲基化是由RdDM(RNA-directed DNA methylation)途径介导的,RdDM途径是植物特有进行甲基化修饰的重要途径。RdDM途径是由小RNA(siRNA)介导的转录水平基因沉默(Transcriptional gene silencing, TGS)调控途径,需要两种特定的RNA聚合酶,Pol Ⅳ和Pol Ⅴ。典型的RdDM途径涉及以下步骤:Pol Ⅳ在靶位点转录出单链RNA(single-stranded RNAs, ssRNAs),经过RDR2复制成双链RNA(dsRNAs),再经过DCL3(DICER-LIKE 3)剪切加工成24nt的siRNAs运输到细胞质中,然后结合到AGO4(Argonaute 4)上重新运输回细胞核,与Pol Ⅴ转录形成的新的长链RNA转录本互补,该长链转录本与AGO4-siRNA复合体一起招募DRM2在特定的靶位点进行甲基修饰。

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图1 植物建立甲基化途径RdDM

Matzke MA, Mosher RA. RNA-directed DNA methylation: an epigenetic pathway of increasing complexity. Nat Rev Genet, 2014, 15(6):394-408


植物维持甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase 1, MET1)、染色质甲基酶(chromomethylase 3, CMT3)、CMT2等酶催化完成的。CG、CHG、CHH等不同的序列环境由不同的甲基化酶催化。

植物主动去甲基化的过程主要由ROS1、DME、DML2和DML3等一系列去甲基化酶催化,通过DNA的糖基化和裂解作用消除甲基化修饰。当DNA复制完成后缺乏DNA甲基转移酶维持甲基化修饰状态或者当甲基化酶缺乏活性时,则诱导被动去甲基化,甲基化胞嘧啶被未甲基化胞嘧啶取代。


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图2 植物DNA甲基化动态机制

Zhang H, Lang Z, Zhu JK. Dynamics and function of DNA methylation in plants. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018 Aug;19(8):489-506.


02
动物DNA甲基化机制

在哺乳动物中,有两种主要的DNA甲基化酶DNMT3A和DNMT3B催化建立甲基化,最近的基因筛选发现了一种新的甲基化酶DNMT3,在控制逆转录转座子方面发挥着特殊作用。另外,还有一种DNMT催化活性辅助因子DNMT3L,与DNMT3A和DNMT3B相互作用并刺激其活性。DNA甲基化酶的羧基末端包含一个高度保守的DNMT结构域(MTase结构域)和两个染色质读取结构域,ATRX-DNMT3-DNMT3L (ADD)和 PWWP。组蛋白H3K4残基的甲基化修饰越多对ADD结构域的排斥作用增强,这时ADD会结合MTase结构域,抑制DNMT3甲基化酶的活性,进而减少对启动子的甲基化修饰作用,启动子的活性增强。当未甲基化的H3K4与ADD结合,释放MTase活性,实现DNA甲基化。与启动子甲基化修饰减少导致基因转录活性提升的情况相反,Gene body区域甲基化修饰作用增强。这是由于RNA聚合酶II (Pol II)转录时,H3K36三甲基化与PWWP结构域结合,释放MTase促进甲基化修饰。

从头DNA甲基化可以在任何序列环境中发生,但只有对称CpG甲基化在DNA复制时可以维持甲基化状态。甲基化酶DNMT1与另一种多结构域蛋白E3泛素蛋白连接酶UHRF1协同介导甲基化的维持。DNMT1本身具有自抑制性,不具备甲基化酶活性。UHRF1的SRA和RING结构域锚定复制过程的半甲基CpG双核苷酸;TTD-PHD结构域特异性结合H3K9me2和H3K9me3;UBL结构域招募DNMT1释放其自抑制作用。DNMT1的RFTS结构域定位到组蛋白H3尾部,MTase在锚定的CpG位置甲基化子DNA链。

主动DNA去甲基化由TET甲基胞嘧啶双加氧酶进行,该酶逐渐将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC) 和5-羧基胞嘧啶(5caC)。全基因组DNA去甲基化是一个仍需要深入挖掘的研究领域。据报道,在人和小鼠生殖系重编过程中发生两步去甲基化。第一阶段,大部分基因组被动去甲基化;随后由TET1和TET2去甲基化酶介导去甲基化,主要影响基因印迹位点和生殖系特异性基因。

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图3 动物DNA甲基化建立和维持

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图4 DNA甲基化酶和去甲基化酶结构

Greenberg MVC, Bourc'his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Oct;20(10):590-607.

二、DNA甲基化检测技术

为何存在甲基化差异,一般却看不见表型变化?

在DNA甲基化对下游通路的调控过程中,作用途径、作用基因的关键性、甲基化修饰的位置区域、修饰水平等等因素都可能引起表型或遗传变化程度的差异。差异甲基化区域少、修饰水平低等造成的综合遗传效应较小,一般不易形成明显的表型改变,但是甲基化修饰的改变确是真切存在,可能在多代遗传后会引起较大的遗传差异。

01
DNA甲基化检测技术简介

1925年,5-甲基胞嘧啶首次在细菌中被发现。自发现DNA甲基化至今已近一个世纪,DNA甲基化已在广泛的生物体中得到研究,并在基因调控、基因组组织、生殖发育以及疾病和衰老等生物学主题中被深入探究。但是,甲基化研究领域还有许多需要深入揭示的机制和调控网络。要解析这些甲基化相关研究难题,只能通过甲基化检测、高通量测序结合生物信息分析来揭示其中奥秘。近年来DNA甲基化研究取得了大量精细成果,离不开研究技术的创新。下面列举了一些用于不同目的研究的DNA甲基化检测技术。

表1 DNA甲基化检测技术(爱基百客可提供)

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02
WGBS测序结果示例

WGBS(全基因组甲基化测序,Whole Genome Bisulfite Sequencing)被公认为是DNA甲基化研究的金标准,在DNA甲基化测序中占据重要地位。它能够在全基因组范围内精确检测所有单个胞嘧啶碱基(C碱基)的甲基化水平,提供单碱基分辨率的甲基化图谱,这是其他许多DNA甲基化检测技术所难以达到的。因此,WGBS被广泛应用于表观遗传学研究、疾病研究等多个领域。

以WGBS为例,爱基百客可提供从DNA提取到建库测序全流程服务,并基于以下分析流程给出全面精细的分析结果和可视化图。

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图5 WGBS分析流程

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图6 数据质控对比

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图7 DMR分布分析

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图8 关联基因GO聚类分析

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图9 关联基因KEGG聚类分析

爱基百客提供多类型甲基化产品,从前期研究全局找到甲基化差异位点,到后续队列验证,有需要欢迎随时与我们联系。

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