空间转录组 | 如何制备冷冻切片样本？

空间转录组学（Spatial Transcriptomics）是一种新兴的多组学技术，它允许研究人员在保持细胞空间位置信息的前提下，分析基因表达模式，具有保持空间信息、高分辨率和多维度分析的特点。

空间转录组学样本的制备需要严格控制，以最大限度地保留组织的原始结构和基因表达信息是确保后续分析质量和可靠性的关键步骤。OCT（Optimal Cutting Temperature Compound）包埋剂是一种用于冷冻切片的化合物，它有助于保持组织样本的形态，并使得样本可以在低温下切割成薄片用于显微镜检查。因此，OCT包埋作为冷冻切片技术中常用的一种方法，广泛应用于病理学、分子生物学、空间转录组学等领域。以下是如何将OCT包埋技术应用于空间转录组学样本制备的流程与注意事项：

• 采集样本：根据研究目的选择合适的样本，确保样本新鲜且无污染。用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）清洗样本表面，去除血液和其他杂质。
  

• 样本的大小：推荐尺寸不超过0.9cm × 0.9cm × 2cm；样本横截面不要小于3mm×3mm，以防止细胞核量较少或者切片产生组织褶皱；如果样本较难获取，样本的高度建议不低于3mm，以保证足够用于质检和正式实验。

• 处理时间：最大限度避免组织内部RNA的降解，建议离体30min内完成包埋。

器材预冷处理→组织准备→冷冻包埋→样本保存

01

器材预冷处理

• 提前将包埋液放置于冰块箱或桶内进行碎冰预冷处理，包埋液禁止来回晃动，防止产生气泡，使用前检查包埋液是否有气泡产生(为防止包埋液中有气泡，可以倒置预冷)。

• 在平皿中加满OCT，提前预冷10min（可使用注射器吸弃产生的气泡）。

• 包埋盒提前标注，确定后续切片的方向，如下图所示，也可以在包埋剂凝固前拍照记录样本大小和方向，方便实验人员快速确定切片方向。

•  将标记好的包埋盒（不含包埋剂）、剪子和镊子进行干冰预冷处理，另取一个包埋盒（作为盖子）反面放在干冰上，表面覆上干冰预冷。

•  建议使用完整干冰块，便于后期目标组织均匀受冷。禁止使用液氮、干冰棍等极端制冷或者不均匀之类的设备，不要直接将样本放入液氮冷冻，沸腾的过程会破坏组织内部形态。

02

组织准备

•  首先，用吸水纸将组织表面的液体尽量吸干，以防止冰晶形成，破坏组织结构（新鲜离体30min以内）。
  

•  之后，请确认切割面并提前切除非目标区域。

•  将目标组织放置预冷的OCT中，在不产生气泡的前提下用药匙使组织被OCT包裹（可使用注射器吸弃产生的气泡）。

03

包埋

• 平稳取出OCT包埋液体，并观察是否有气泡，将OCT包埋液体前端部分弃之不用，确保使用时无气泡产生。

•  在包埋盒底部加入少量OCT包埋液，避免目标组织直接接触包埋盒底部，可不用等包埋液凝固。

• 使用预冷的镊子将组织放入包埋盒中，注意关注的组织面需要平行放于包埋盒底部位置，切面应保持在同一水平面。

•  继续加入OCT包埋液直到完全包裹目标组织，注意连续挤出包埋液不要产生气泡，如有不可避免的气泡产生，可使用1ml移液器吸出或用镊子去除。

• 再次观察组织是否完全包埋，如未完全包埋，需再覆盖一层包埋剂后，包埋盒上方再覆盖预冷好的包埋盒，让目标组织均匀受冷，快速冷冻，减少冰晶产生，等待完全凝固变白再进行下一步操作。

•  组织块完全凝固并变成白色，用手轻轻掰包埋盒两侧，即可使OCT包埋块从包埋盒中脱模。

•  检查包埋块底部是否被完全覆盖，如未完全覆盖，则将组织块放置在预冷的金属块上，底部朝上，在表面涂上OCT，直至将组织完全覆盖。

•  若组织样本很小，建议多个样本同时包埋（如右图为多个小鼠卵巢样本同时包埋），多个样本一起包埋需要注意关注的切面尽量保证能在同一平面。

04

样本保存

•  将处理完整的包埋目标组织以及样本名称标签纸一起放入密封袋中，标注样本名称，便于区分样本。

  注意：非密封环境会导致目标组织脱水，破坏组织形态。

• 将OCT包埋好的组织放入密封袋中，放入-80℃冰箱保存，建议冻存时间不超过3个月。
  

• 如果未及时进行包埋的样本，用吸水纸将组织周边的液体吸取干净，干冰速冻，可放-80℃进行储存，短期内安排OCT包埋。

• 在操作过程中要保证样本的完整性，避免组织变形或损伤。

• 包埋剂的选择和处理条件需根据样本类型和后续实验要求进行调整。

• 操作应在低温环境下进行，以防止OCT和组织样本融化。

本期的介绍就到这里了，如有相关技术需求，欢迎联系我们。祝大家科研顺利，发文就发CNS~

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