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项目文章 | Cell Rep Med &SGLT2抑制剂达格列净可改善高尿酸血症肾病的肾纤维化由武汉大学人民医院、海南省总医院以及首都医科大学宣武医院合作共同在《Cell Reports Medicine》期刊发表题为The SGLT2 inhibitor dapagliflozin ameliorates renal fibrosis in hyperuricemic nephropathy文章,本研究利用RNA-seq、ChIP-seq、WB、免疫荧光等实验方法在细胞以及实验动物层面阐述了达格列净改善高尿酸血症肾病的肾纤维化的调控机制,为使用达格列净治疗非糖尿病肾病提供更为深入的理论基础。 本研究聚焦于高尿酸血症(hyperuricemia (HUA))发展为高尿酸血症肾病(hyperuricemic nephropathy (HN))中肾小管纤维化(tubulointerstitial fibrosis (TIF))。高尿酸血症是指血液中尿酸水平升高,这不仅与痛风有关,还可能引起肾脏损伤,导致肾功能下降和肾脏结构的改变。肾纤维化是慢性肾脏疾病(CKD)进展的关键病理过程,涉及细胞外基质的异常积累和肾脏组织结构的破坏。SGLT2抑制剂达格列净(dapagliflozin)是一种用于治疗2型糖尿病的药物,能够减少肾脏对葡萄糖的重吸收,从而降低血糖水平。近年来,研究者发现SGLT2抑制剂可能对非糖尿病患者的肾脏疾病也有潜在的保护作用,但其在高尿酸血症肾病中的作用机制尚不清楚。 本研究的核心思路是探索SGLT2抑制剂达格列净(dapagliflozin)对高尿酸血症肾病(hyperuricemic nephropathy,HN)引起的肾脏纤维化的影响。研究者们首先假设达格列净能够通过影响特定的细胞类型和分子途径来减轻肾脏纤维化。接着对于数据库中人肾脏snRNA数据分析不同细胞中标志基因表达;在细胞层面,小鼠组织层面进行氧化应激、线粒体功能、RNA-seq、ChIP-seq,免疫组化、扫描电镜等技术方法研究达格列净对高尿酸血症诱导的肾脏纤维化的影响,包括对肾脏组织病理变化的改善、对纤维化相关蛋白表达的调节以及对线粒体功能和细胞能量状态的改善。 1. 达格列净减轻HN患者的肾功能不全和纤维化 鉴于TIF是HN的共同特征,作者对HN患者的肾脏标本进行H&E和Masson染色,结果显示出有严重的肾小管病变(管腔扩张、上皮空泡化/扁平化、细胞核暴露和刷状缘损失)以及胶原沉积(图1A和1B),而免疫荧光(IF)结果显示HN患者的肾小管中纤维化标志物aSMA和FN1上调(图1C)。此外,HN患者的肾小管表现出线粒体形态异常,TOM20(线粒体标志物)荧光强度有所降低(图1D和1E)。 作者将HN小鼠的肾脏和暴露于UA的细胞进行RNA-seq,分析数据表明纤维化和炎症标志物的显著上调(图1F~I)。qRT-PCR结果也同时验证了HN和UA中aSMA和FN1表达水平的上升,证实了纤维化途径的激活(图1H~ K)。目前,在临床试验中观察到达格列净(一种高度选择性SGLT 2(1 L中的2D和3D化学结构)抑制剂)对UA的降低作用,然而具体机制尚不清楚。因此,作者评估了肾纤维化和肾存活的相关性以评价达格列净在HN患者中的疗效。如图1 M~O所示,HN中的达格列净表现出抗纤维化和肾保护作用。 图1达格列净对HN患者肾纤维化的影响 2. 达格列净可逆转HN小鼠的功能指标和病理损伤 作者通过经口服灌胃腺嘌呤(0.16g/kg)和氧酮酸钾(2.4g/kg)建立了HN的小鼠模型(图2A)。与HN患者中的观察结果一致,HN小鼠显示肾功能参数和组织病理学显著改变(图2B~F)。为了评估达格列净对HN小鼠的影响,作者使用1.0 mg/kg的达格列净对HN小鼠模型进行处理(图2G)。如预期的,HN +达格列净组表现出比HN组更低的血清UA、Cr和BUN水平(图2 H~J)。H&E染色结果也显示出达格列净还有效改善了HN小鼠的病理损伤(图2K~L)。此外,透射电子显微镜(TEM)分析表明,达格列净也缓解了线粒体的形态和结构异常(图2 M~N)。免疫荧光、WB结果均显示纤维化标志物aSMA和FN 1在达格列净处理后的HN小鼠中下调(图2O~R)。作者将达格列净的影响和对应目前所用一线降低UA药物别嘌呤醇治疗结果比较,HN +达格列净小鼠的肾功能和组织病理学表现出与HN+别嘌呤醇(ALL)小鼠相当的趋势。研究结果表明,达格列净有效缓解HN小鼠的肾功能不全和纤维化。 图2 达格列净对HN小鼠肾纤维化的影响 3. 达格列净恢复HN小鼠和HN患者的ERRα表达 作者利用全基因组关联分析,HUA的发生率与负责尿酸盐转运蛋白表达的基因的遗传多态性之间存在密切关联。其中高度相关转运蛋白有GLUT 9、URAT 1、OAT 1、NPT 1、ABCG 2和MRP 4,在肾近端小管中尿酸盐的吸收或排泄中发挥关键作用。通过分析来自小鼠肾RNA-seq数据的大量差异表达基因(DEG)也显示出转运蛋白的表达失调。尿酸盐转运蛋白的转录调控在维持血清UA稳态中有着重要作用。与此同时,GO富集分析显示有“DNA-binding transcription factor binding”富集,启示参与DNA结合转录因子(TF)在HN的生物学过程中起着至关重要的作用。接下来,通过RNA-seq中相关DNA结合TF表达情况比较,锁定到转录因子ERRα(补充图S2B-G)。以往研究中ERRα已被认为是驱动与肾脏疾病严重程度的主要转录因子。 作者对来自肾脏snRNA-seq数据进行的分析也证实了慢性肾病(CKD)患者和HN小鼠中ERRα阳性TEC(肾小管上皮细胞)的一致趋势(补充图S2H)。此外,使用HN患者和HN小鼠模型的肾脏标本进行的免疫组织化学(IHC)和IF染色显示ERRα表达出现降低,而达格列净显著提高了ERRα表达(补充图S2I~L)。这些发现表明ERRα缺乏可能通过调节尿酸转运蛋白的转录而促进HN的进展。更重要的是,达格列净可通过恢复ERRα表达来缓解HN。 补充图2 HN患者和达格列净治疗小鼠中ERRα表达的变化。 4. 达格列净激活ERRα对UA诱导的TEC和HK-2细胞损伤的保护作用 作者将TEC和HK-2细胞分为四个亚组:对照组、对照+达格列净组、UA组和UA +达格列净组。体内观察、蛋白质印迹(WB)和IF分析表明,达格列净处理缓解了TEC和HK-2细胞中UA诱导的纤维化变化,而ERRα蛋白表达呈现上升趋势(图3A- 3C)。此外,达格列净处理后线粒体形态也发生了变化。在处理组中,观察到伸长的、管状的和完整的线粒体,而未处理对照组中观察到丰富的圆形、小的和肿胀的线粒体(图3D和3E)。用UA刺激的TEC中的耗氧速率(OCR)、ATP水平和线粒体形态改善以及活性氧(ROS)产生减少(图3F-3 I),进一步证明达格列净对于线粒体的有益作用。 鉴于达格列净对ERRα的潜在介导作用,作者进行了分子对接分析,结果显示达格列净与ERRα之间存在强结合相互作用(图3J)。作者采用了细胞热位移试验(CETSA)和药物亲和力响应靶点稳定性(DARTS)试验,结果进一步表明达格列净可能直接靶向ERRα蛋白。此外,表面等离子体共振和微尺度热泳分析证明达格列净和ERRα蛋白之间具有稳健的亲和力(图3K和3L)。 鉴于之前ERRα表达的有益作用,作者转染腺相关病毒ERRα(AAV-ERRα),观察过表达ERRα是否可以有效保护TEC和HK-2细胞免受UA诱导的损伤。与达格列净处理一致,ERRα过表达导致两种类型的UA暴露的细胞中aSMA和FN1的荧光和灰度显著降低,表明了其有效的抗纤维化作用(图3 M~Q);TEM分析还同时揭示了UA + AAV-ERRα组中线粒体损伤的显著修复(图3R~S)。总之,这些发现强调了达格列净通过靶向ERRα在UA暴露的TEC和HK-2细胞中的抗损伤和抗纤维化作用的调节机制。 图3 达格列净处理以及ERRa过表达在UA处理的TEC和HK-2细胞中的作用 5. 在ERRα耗竭或抑制的情况下,达格列净对UA诱导的HK-2细胞损伤没有影响 传统观点认为达格列净对HN的保护作用是这是基于SGLT 2抑制,因此作者使用CRISPR-Cas9在HK-2细胞建立了SGLT 2敲除(KO)细胞系(图4A)。尽管SGLT 2耗竭,但观察到达格列净仍可显著预防UA诱导的纤维化和线粒体功能障碍。这表明,达格列净对HN的保护机制可能与SGLT 2的抑制无关(图4 B~G)。此外,SGLT 2耗竭并不影响ERRα表达(图4 B~C)。 随后,作者建立了ERRα-KO细胞系(图4 H)。WB、IF和OCR结果显示ERRα耗竭导致UA诱导的HK-2细胞损伤更为严重(图4 I~M)。通过纤维化标志物上调、ROS过度生成、线粒体片段化以及OCR和ATP减少证明说明达格列净在预防ERRα-KO细胞系中UA诱导的纤维化和线粒体功能障碍方面无效(图4 I~ N)。XCT-790(化合物12)是一种强效和选择性ERRα反向激动剂,XCT-790可抑制ERRα水平并增强FN1、aSMA表达,导致线粒体肿胀和缩短更加严重。总之,这些结果进一步表明ERRα是达格列净的下游靶点且不依赖于SGLT 2。 图4 达格列净在UA处理HK-2 SGLT 2-/ ERRa-KO细胞的中的作用 6. 肾小管特异性ERRα过表达减轻HN小鼠肾功能不全和纤维化 为了研究ERRα与HN发展之间的直接关联,作者构建了肾小管特异性ERRα过表达(ERRαptKI)小鼠(图5A)。PCR、WB确定了ERRα的有效敲入(图5B~D)。在肾功能指数方面,与ERRαControl小鼠相比,ERRαptKI小鼠未表现出明显变化,但在HN建模处理后,与ERRαControl小鼠相比,ERRαptKI小鼠表现出显著缓解(图5E~ H)。同时病理学实验中HN模型化的ERRαptKI小鼠的肾脏显示出胶原积累、肾小管病变和线粒体损伤减轻(图5I-5 N)。此外,aSMA和FN1的荧光和灰度降低进一步证实了ERRα基因过表达对HN小鼠肾纤维化的抑制作用(图5O~P)。这些结果强调了ERRα在HN治疗中的治疗意义。 图5 肾小管特异性ERRα过表达在HN小鼠中的作用 7. ERRα与OAT 1结合进行转录调节 OAT1(SLC 22 A6/NKT)是一种多特异性转运蛋白,主要定位于肾脏近曲小管的基底外侧膜且与尿酸分泌有关。已有研究表明OAT 1失调会破坏尿酸代谢并增加HUA的风险。最近的研究表明,雌激素受体a(ERa)可间接激活OAT 1,表明其活性部分受雌激素依赖性转录机制调节。RNA-seq分析结果表明干扰(si)-ERRα的HK-2细胞相对于对照的差异途径,包括酪氨酸代谢、多巴胺能突触、烟酸盐和烟酰胺代谢、Wnt信号传导途径、转化生长因子B(TGF-B)信号传导途径等途径(图6A)。先前已报道这些通路与HUA的发病机制有着密切的关联。随后,作者在HK-2细胞中利用染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)(图6 B)鉴定了OAT 1基因与ERRα蛋白的结合位点,ChIP-qPCR结果进一步验证ERRα蛋白富集在OAT 1基因片段上(图6C)。OAT 1基因中的ERRα靶向基序motif见图6D,蛋白质-DNA对接模拟揭示了ERRα蛋白和OAT 1基因之间的最佳匹配模式(图6 E)。此外,在mRNA和蛋白质水平,观察到AAV-ERRα的ERRα过表达拯救了OAT 1水平,而si-ERRα下调了OAT 1表达(图6 F~ G)。双荧光素酶报告基因测定也证明了对应结果的一致性(图6 H)。此外,WB分析进一步支持了以上结果(图6 I~J)。总之,这些发现强调了ERRα对OAT 1有着直接的转录调节作用。 图6 HK-2细胞中的ERRa-OAT 1轴 8. 达格列净通过激活ERRα-OAT 1轴改善HN肾脏和UA处理的肾小管细胞的纤维化变化 为进一步验证达格列净对HN的有利作用是通过ERRα-OAT 1轴增强,作者进行了OAT 1蛋白表达与功能参数的相关性分析和IHC实验;结果显示OAT 1与血清UA呈负相关,与血清Cr和尿白蛋白与肌酸酐比率无明显相关性(图7 B~E);与之前的研究结果一致,IHC结果观察到HN患者近端小管中OAT 1阳性细胞数量明显减少(图7A)。免疫荧光染色也证实了HN患者中OAT 1表达的降低(图7 F),并且发现达格列净处理组可逆转OAT I表达(图7A和7 F)。此外,作者在HN或UA条件下对小鼠、TEC和HK-2细胞进行的WB,结果显示OAT 1蛋白水平下调,达格列净处理可抵消此作用(图7 G~K)。之后,将OE-OAT 1转染到TEC和HK-2细胞中,FN 1和aSMA的上调(图7 L~O)。总之,这些结果都证实了达格列净通过靶向ERRα-OAT 1轴在HN中保护肾纤维化的关键应用。 图7 HK-2细胞中的达格列净对HN或UA条件处理下肾小管细胞中ERRα-OAT 1轴表达的变化 9. 达格列净减轻非HN CKD小鼠模型和高糖或TGF-b处理的TEC模型中的纤维化变化 上述结果表明ERRα-OAT 1轴的激活可能是达格列净诱导细胞凋亡的机制之一。HUA是CKD患者的常见现象。目前,达格列净已被批准用于CKD的临床治疗。然而,达格列净对CKD的治疗效果与ERRα-OAT 1轴之间的关系仍然是一个值得进一步研究的主题。作者利用三种不同的方法构建非HN CKD小鼠模型:高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠、db/db 2型糖尿病肾病(DKD)小鼠和单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠。随后,施用4周的达格列净治疗以评估其对肾功能指数和病理损伤的影响。在三种非HN CKD小鼠模型中,作者观察到了达格列净可以降低血清UA、Cr和BUN,以及减轻肾小管病变和胶原沉积;以及通过WB确定了ERRα-OAT 1轴的增强(补充图图S6)(图S6 E~ J)。这些数据对于此研究有进一步的拓展,说明ERRα-OAT 1轴调节剂达格列净也可以减轻非HN CKD小鼠模型和相应肾小管细胞的纤维化变化。 补充图6 达格列净在非HN CKD小鼠模型中的作用 总之,本研究确定了达格列净促进UA排泄至肾小管管腔的机制。这种效果是通过靶向ERRα-OAT 1轴实现的,随后导致血清UA水平降低。值得注意的是,UA水平的降低在缓解HN和非HN CKD中的TIF中起着关键作用。本研究的结果有助于深入了解使用达格列净治疗非糖尿病肾病的机制,为达格列净在非糖尿病肾脏疾病的临床应用提供了更全面的理论依据。 达格列净缓解HN中肾纤维化机制图 武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),位于武汉高农生物园,是一家专业提供表观组学科研服务、单细胞与空间组学测序分析和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。公司先后引入ChIP、WGBS、ATAC-seq、DNBSEQ-T7、10x Genomics、SeekOne® DD、DNBelabC-TaiM4和Stereo-seq等实验平台,不断提升公司的科研服务能力。 运营至今合作的科研客户超2000家,涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业,科研成果曾多次在Science、Cancer Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL、Plant Cell 等国际高水平学术期刊发表,受到了客户广泛好评,是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。 项目咨询 了 解 更 多 { 往 期 精 彩 回 顾 } 精选合集,欢迎收藏哟! |