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项目文章 | Dev Cell 陕西师范大学研究团队发表棉花纤维发育中的作用及调控机制


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近日,陕西师范大学肖光辉课题组在期刊Developmental Cell(IF=10.7)发表题为Strigolactone promotes cotton fiber cell elongation by de-repressing DWARF53 on linolenic acid biosynthesis的文章,本研究利用ChIP-seq、DAP-seq、RNA-seq、Y1H/Y2H、Dual-LUC、EMSA等技术方法探究GhD53在棉花纤维发育中的作用及调控机制。爱基百客为该研究提供DAP-seq的技术支持

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  研究背景  


细胞伸长是植物生长的基本细胞过程,对器官发育和生长至关重要。棉花纤维作为研究植物细胞伸长的优秀模型,其发育包括起始、伸长、次生细胞壁合成和成熟四个阶段。陆地棉纤维具有重要商业价值。随着对棉花基因组认识的增加,通过基因手段改善棉花纤维特性变得更加可行。植物激素在植物生长、发育和对外部刺激的响应中起关键作用。独脚金内酯(SL)在调节植物生长和发育中具有重要地位,它对花青素积累、根系结构、叶片发育、花大小、株高以及对干旱、耐热、耐寒和缺磷的适应等都有影响。其生物合成途径已明确,感知依赖于特定蛋白,且通过一系列蛋白相互作用调控相关基因表达。然而,大多数研究是从宏观表型角度,其在植物细胞发育中的作用仍不清楚,且对其介导的信号通路的理解滞后于生物合成途径,虽然已知SL促进纤维细胞伸长,但SMXL/D53在SL调节的细胞伸长中的精确作用和调控机制仍不清楚。

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  研究思路 


通过对GhD53基因的表达分析、亚细胞定位分析以及构建转基因植株等方法,研究GhD53对棉花纤维细胞伸长的影响。利用染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和RNA测序(RNA -seq)等实验技术,分析GhD53的靶基因,以及SL对GhD53调控的影响。通过酵母单杂交、双荧光素酶报告基因检测、电泳迁移率变动分析(EMSA)等实验,研究GhD53与转录因子GhSLRF的相互作用以及对靶基因的调控机制。

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  研究结果 


1. GhD53通过抑制亚麻酸生物合成抑制棉纤维细胞伸长

在棉花(Gossypium hirsutum, Gh)中,存在六个不同的D53基因。对棉花和拟南芥D53基因的系统发育分析表明,GhD53-5和GhD53-6的关系最近,而GhD53-1和GhD53-4较近。这些GhD53基因中的四个(GhD53 -3、-4、-5、-6)在胚珠和纤维发育阶段都表现出较高的表达。在这些GhD53变体中,只有GhD53-6具有与其自身启动子结合的能力,并对其自身转录进行负调控。此外,在合成独脚金内酯类似物rac-GR24(GR24)处理后,GhD53-6蛋白积累减少。作者后续选择了GhD53-6进行进一步研究。烟草亚细胞定位实验结果证实GhD53蛋白主要定位在细胞核内。GhD53基因在棉花纤维发育的关键阶段(DPA10-20)表达量最高;然而随着棉纤维生长,GhD53蛋白的积累逐渐减少。为了进一步了解GhD53对棉花纤维发育的影响,作者构建了GhD53-OE植株和GhD53-RNAi植株(图1A,1B)。GhD53的过表达植株中棉花球重量、成熟纤维长度、植株高度和种子重量均出现降低(图1C-F)。GhD53–RNAi植株对应出现相反的表型。

此外,研究观察到过表达GhD53减弱了GR24对纤维生长的积极作用,而干扰GhD53基因表达部分减轻了GR24对纤维生长的积极作用。Tis108(SL生物合成抑制剂)对纤维伸长的抑制作用(图1G和1H)。这些发现表明GhD53作为负调节剂起作用,介导SL信号,从而在调节纤维发育中起关键作用。

为了探究GhD53结合下游靶基因情况,作者对GhD53-OE棉花植株进行了染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)和转录组测序(RNA-seq)分析(图1 I和1 J);联合分析并鉴定了202个在纤维伸长阶段(10-DPA)具有高表达水平的基因。KEGG富集分析结果显示,GhD53靶基因主要与α-亚麻酸代谢途径相关(图1 K)。此外,作者在富集途径中鉴定了两个亚麻酸生物合成基因(GhFAD3-2A与GhFAD3-4D),基因启动子区均含有TTGTTAT(ATAACAA)元件。作者平行进行了DNA亲和纯化测序(DAP-seq)分析。同时对用GR24或Tis108处理的纤维进行了RNA-seq分析,并鉴定了24,485个差异表达基因(DEG)。其中,GR24处理后481个上调,751个下调,而Tis108处理后6088个上调,17165个下调。随后的KEGG途径富集分析结果也进一步强调了这些富集的DEG参与脂肪酸延伸途径。

综上结果表明GhD53介导SL信号的来调节亚麻酸的生物合成。GhD53-OE与野生型相比较棉纤维中亚麻酸(C18:3)的水平显著降低(图1 L- M)。值得注意的是,C18:3的处理后成功地恢复了由GhD53过表达引起的缩短的棉纤维的现象(图1 N和1 O)。此外,用C18:3处理也显著增强了GhD53-RNAi棉纤维中的纤维伸长。GhD53-RNAi转基因棉花和应用抑制剂Tis108时,则结论正好相反。

在与脂肪酸合成相关的基因中,FAD3在催化C18:2合成C18:3中起关键作。在棉花中,有11个FAD3基因,其中GhFAD3-2A/D(GhFAD3-2)和GhFAD3-4 A/D(GhFAD3-4)显示具有57.37%蛋白质序列相似性以及在纤维伸长期间都是较高表达水平。重要的是,ChIP-seq分析发现,GhD53结合在GhFAD3-2和GhFAD3-4的启动子区域(图1 P-Q)。

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图1 GhD53对棉纤维细胞伸长的负调控作用

2. GhFAD3-2和GhFAD3-4是GhD53调节SL介导的纤维细胞伸长的两个主要靶点

先前的研究已表明D53蛋白对靶基因启动子内的ATAACAA元件具有较高结合亲和力。GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子内鉴定到了三个和两个TTGTTAT(ATAACAA)元件。为了进一步验证GhD53与GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子之间的结合活性,作者进行了酵母单杂交(Y1H)实验。结果表明,GhD53不仅直接结合全长P3,和P3 m1(其在第一结合位点含有突变)片段的GhFAD3-2启动子相互作用,同时也与全长和GhFAD3-4启动子的F4片段相互作用(图2A和2B)。值得注意的是,当P3的第二个结合位点突变(P3 m2)或当F4内的结合位点突变(F4 m)时,这些结合相互作用被破坏。通过烟草瞬转双荧光素酶试验进一步验证了这些互作(图2C-2 H)。凝胶迁移阻滞实验(EMSA)进一步证实了GhD53蛋白与L1和L2探针的结合亲和力。关键的是,TTGTTAT(ATAACAA)结合位点内的突变消除了它们与GhD53的相互作用(图2 I-L)。


GhD53蛋白包含四个保守结构域。烟草瞬转和双荧光素酶测定以及Y1H确定了P-loop结构域具有结合GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子的能力(图2 M-2 O)。EMSA和ChIP-qPCR进一步证明了上述结果图2 P-2U)。


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图2 GhD53蛋白直接结合GhFAD3-2/GhFAD3-4启动子区域

接下来为进一步探究GhD53与靶基因结合的对应关键蛋白结构域,作者突变相应蛋白,结果表明具有突变的P3-2基序的P-loop失去了其结合GhFAD3-2-P3和GhFAD3-4-F4片段的能力,这意味着P3-2基序在GhD53与GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子的相互作用中的关键作用。这些结果表明,GhD53蛋白中的P-loop结构域在与GhFAD3-2启动子中的第三个TTGTTAT(ATAACAA)顺式元件和GhFAD3-4启动子中的第二个顺式元件结合中起关键作用。为了研究GhFAD3-2在棉花中的功能,构建GhFAD3-2-OE和GhFAD3-2-RNAi转基因棉花植株。结果显示,GhFAD3-2的过表达增强了GhFAD3-2转录物和蛋白质的积累以及亚麻酸C18:3含量,导致棉铃重量、纤维细胞长度和起始、植物高度和成熟种子重量增加;相反,GhFAD3-2转录的抑制导致相反的结论(图3A-E)。C18:3挽救了在GhFAD3-2-RNAi品系中观察到的短纤维长度并促进了GhFAD3-2-OE棉花中的纤维伸长,而C18:3抑制剂(甘珀酸)降低了GhFAD3-2-OE品系中的长纤维表型并抑制了GhFAD3-2-RNAi棉花中的纤维伸长(图3F、3 H)。与野生型相比,用GR24处理的GhFAD3-2-RNAi棉花产生更短的纤维。相比之下,在Tis108处理后,GhFAD3-2-OE棉花相对于野生型产生更长的纤维(图3G和3 I)。

此外,GhFAD3-4在其伸长阶段(5-15 DPA)期间表现出较高的表达。随后,作者制备过表达或敲除GhFAD3-4的转基因植物。类似于在GhFAD3-2过表达系中观察到的结果,GhFAD3-4的过表达导致亚麻酸含量、棉铃重量、纤维长度、植物高度、种子重量和纤维起始都对应增加(图3 J-3 N)。相反,GhFAD3-4的敲除导致相关指标显著降低(图3 J-3 N和S4 AB-S4 AI)。在体外胚珠培养中,C18:3补充可以挽救GhFAD3-4-KO系中的短纤维长度,而C18:3抑制剂减少GhFAD3-4-OE系中的延长纤维表型(图3 O和3Q)。此外,在GR24处理后,GhFAD3-4-KO植物与野生型相比产生更短的纤维,GhFAD3-4-OE系表现对应相反的结果(图3 P和3R)。综上,结果表明GhFAD3-2和GhFAD3-4作为SL信号下游的棉花纤维发育的正调控。

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图3 GhFAD3-2促进棉花纤维细胞伸长

3GhD53与转录因子GhSLRF相互作用

先前报道D53蛋白通过与其他转录因子的相互作用而发挥转录抑制因子的功能。在本研究中,发现与GhD53相互作用的转录因子是碱性螺旋环螺旋(bHLH)家族蛋白,命名为GhSLRF(图4A)。通过体内双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(COIP)结合体外GST pull-down实验的进一步证实了GhD53和GhSLRF之间的相互作用(图4 B-4D)。GhD53除了其DNA结合能力用于直接基因转录调节之外,还具有与其他转录因子如GhSLRF相互作用的能力(图4 E-4 H),使得能够向下游传递SL信号以调节棉纤维发育。

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图4 GhD53直接与GhSLRF相互作用

4. GhSLRF是纤维细胞伸长的正调控因子,直接与GhFAD3-2和GhFAD3-4的启动子结合

GhSLRF基因在棉纤维的伸长和次生细胞壁增厚阶段期间表现出较为稳定的表达,为了研究GhSLRF在棉花中的作用,作者制备了过表达或敲除GhSLRF的转基因棉花植株(图5A、5 B)。GhSLRF在棉花中的过表达导致棉铃重量、纤维长度、植物高度、起始纤维细胞数量和成熟种子重量增加(图5C-5 F)。相反,GhSLRF的敲除导致相应指标降低(图5C-5 F)。此外,用SL类似物GR24处理的GhSLRF-KO转基因系未能将其纤维长度恢复到与GR24处理的野生型纤维相同的程度。SL生物合成抑制剂Tis108对GhSLRF-OE转基因植株纤维伸长的抑制作用不明显。这些结果表明,GhSLRF在SL信号下游起作用以调节棉纤维伸长(图5G和5 H)。


GhSLRF,一种bHLH型转录因子,定位于细胞核。GR24处理促进了GhSLRF-OE棉花中的纤维伸长,而Tis108处理抑制了GhSLRF-KO棉花中的纤维伸长。用GR24处理后GhSLRF的表达上调,用Tis108处理后GhSLRF的表达下调。为进一步探讨棉花纤维发育过程中GhSLRF的下游靶点,作者进行GhSLRF转基因棉纤维的ChIP-seq和RNA-seq,其鉴定了GhSLRF过表达后9034个上调的基因。ChIP-seq结果中6.51%(22719个peak)位于启动子区,对应于20651个基因。先前的研究已经报道了bHLH蛋白与靶基因启动子中的E-box元件的结合。对基因区域内结合位点motif分析E-box确定为GhSLRF下游基因启动子区域中的重要结合基序(图5I)。通过比较RNA-seq和ChIP-seq联合分析,发现了2622个基因,这些基因在GhSLRF过表达后均上调并直接与GhSLRF结合(图5 J)。KEGG富集分析表明,GhSLRF靶基因主要富集在脂肪酸调节途径中(图5 K)。

脂肪酸谱分析鉴定了亚麻酸在GhSLRF过表达系的纤维中的显著积累,而GhSLRF的敲除导致亚麻酸含量降低(图5L)。GhSLRF-KO植物的短纤维表型可以被外源C18:3挽救,而在GhSLRF-OE植物中观察到的增强的纤维伸长在用C18:3生物合成抑制剂甘珀酸处理后受损。这些结果意味着GhSLRF调节亚麻酸以控制纤维发育(图5 M和5 N)。

鉴于GhFAD3-2和GhFAD3-4在纤维伸长过程中高表达,并且它们的转录都受SL的调控,作者探究了GhSLRF与GhFAD3-2和GhFAD3-4之间的调控关系。结果表明,GhSLRF的过表达上调了GhFAD3-2和GhFAD3-4的转录,而敲除GhSLRF则抑制了它们的表达(图5o和5p)。ChIP-seq结果证明GhSLRF与GhFAD3-2和GhFAD3-4的启动子区域有很强的结合(图5Q和5R)。

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图5 GhSLRF促进棉花纤维细胞伸长

为了阐明GhSLRF对GhFAD3-2和GhFAD3-4转录的调控机制,作者进行了Y1H和烟草瞬转试验,证实GhSLRF直接与它们各自的启动子结合(图6A-6C)。进一步的实验,包括双荧光素酶分析和EMSA,发现关键的顺式元件位于GhFAD3-2启动子的P3或L1片段和GhFAD3-4启动子的F4或L2片段,使GhSLRF蛋白能够与这些启动子结合(图6D-6M)。突变分析则确定了特定结合位点对这种相互作用的重要性(图6D-6M)。GhSLRF包括两个结构域,bHLH和ACT_UURACR-like(ACT)。Y1H和烟草瞬转分析结合EMSA实验表明,GhSLRF的bHLH域,而不是ACT域,负责与GhFAD3-2启动子的P3或L1片段和GhFAD3-4启动子的F4或L2片段中对应结合域(图6N-6V)。ChIP实验进一步证实GhSLRF被招募并与GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子结合(图6W和6X)。这些发现共同证实了GhSLRF的bHLH域具有与GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子中的E-box顺式元件结合的活性,从而激活了这些基因的转录。


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图6 GhSLRF蛋白直接结合GhFAD3-2和GhFAD3-4的启动子区域

5. SL消除GhD53和GhSLRF之间的相互作用,激活GhFAD3-2和GhFAD3-4上GhSLRF的转录活性

双荧光素酶测定实验表明,GhD53结合GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子且对应发挥抑制作用。重要的是,当GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子中发现的GhD53结合位点发生突变时,这种抑制作用消失(图7A和7B)。这些发现表明,GhD53结合GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子抑制其转录。相反,GhSLRF结合GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子表现出激活效应。然而,当GhD53与GhSLRF共表达时,这种激活被显著抑制。当外源GR24的加入减轻了这种抑制作用(图7C和7D)。此外,GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子中SLRF结合位点的突变导致与GhSLRF共表达时荧光素酶活性降低。然而,GR24处理后消除了GhD53对GhFAD3-2和GhFAD3-4的抑制作用(图7E和7F)。此外,突变GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子内的D53的结合位点,消除了GhD53对天然GhFAD3-2或GhFAD3-4启动子驱动的荧光素酶活性的抑制作用(图7G和7H)。这些发现共同表明,SL干扰GhD53与GhFAD3启动子的结合以及GhD53与GhSLRF的相互作用,最终导致GhFAD3-2和GhFAD3-4转录的激活。

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图7  SL缓解了GhD53对GhSLRF激活下游GhFAD3-2和GhFAD3-4基因转录的抑制作用

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  研究结论  


总之,该研究确定了GhD53在棉纤维发育中的双重调节作用(图7I)。在缺乏SL的情况下,GhD53主要作为转录因子直接结合GhFAD3-2和GhFAD3-4启动子,从而抑制其转录。此外,GhD53作为转录激活因子GhSLRF的相互作用因子,阻断GhFAD3-2和GhFAD3-4上GhSLRF的结合和转录激活。GhD53的这种双重调控机制抑制了亚麻酸在纤维中的生物合成,最终导致纤维变短。相比之下,在SL存在下,GhD53蛋白被降解,消除其对GhFAD3-2和GhFAD3-4的转录抑制,同时增强其相互作用蛋白GhSLRF的转录活性,激活GhFAD3-2和GhFAD3-4的表达。这增强了亚麻酸在纤维中的生物合成,促进了纤维的伸长。

本研究以典型思路展开,从基因过表达及干扰后表型变化入手探究基因功能,在转录因子过表达体系进行ChIP-seq寻找靶基因,并通过BiFC、双荧光素酶、EMSA和酵母单杂分析蛋白与DNA的结合域;采用COIP和GST pulldown研究转录因子互作蛋白,构建整体调控网络。研究层层深入、稳步推进,具有很高的借鉴价值。

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