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项目文章(J Hepatol&IF:26.8)| CUT&Tag+转录组解析组蛋白新型修饰H3Q5ser调控HCC的发生机制肝细胞癌(HCC)是一种侵袭性恶性肿瘤,缺乏有效的治疗选择。由于进展迅速和治疗耐药,HCC患者的长期生存率并不理想。继续探索HCC进展的分子机制和确定新的靶向治疗方法以改进现有的治疗策略仍然非常重要。神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)也就是血清素,在肝癌细胞的免疫调节、血管生成、增殖和转移中起着至关重要的作用,然而其调控机制仍不明确。2019年3月,一篇Nature的文章发现5-HT能够通过TGM2调控H3Q5ser影响大脑神经元分化和发育。而5-HT与TGM2作为肝细胞癌中可能的促进因子,两者关联以及影响H3Q5ser参与的调控机制需要被进一步研究。 近日,华中科技大学同济医学院附属同济医院肝脏外科的陈孝平院士、张必翔教授、张学武研究员在顶刊Journal of Hepatology(IF:26.8)发表了题为“TGM2-mediated histone serotonylation promotes HCC progression via MYC signalling pathway”的研究论文。研究发现TRIM28介导TGM2向MYC募集,促进H3Q5ser修饰MYC靶基因,从而促进HCC进展。此外,靶向TGM2转谷氨酰胺酶活性并与索拉非尼协同,具有作为HCC治疗方案的潜力。爱基百客Igenebook为该研究提供了CUT&Tag以及转录组的技术服务,协助寻找调控关键靶点。 图1 TGM2调控介导模型 IGENEBOOK 研究结果 一、5-HT在HCC肿瘤组织中积累 为了评估HCC中的色氨酸代谢水平,作者分析了已发表的数据集,并证明主要的分解代谢途径犬尿氨酸(Kyn)途径在HCC中受到抑制。此外,与邻近的非肿瘤组织相比,HCC组织中色氨酸羟化酶1(TPH1,外周组织中5-HT合成的限速酶)的表达升高,提示HCC中Trp代谢的5-HT通路可能比邻近非肿瘤组织更活跃。 为了评估5-HT的摄取,作者测量了来自同济队列1的血清5-HT浓度,结果显示与健康供者相比,HCC患者的5-HT水平显著升高。此外,血清素转运体SERT和ENT4在肿瘤组织中高表达。负责降解5-HT的单胺氧化酶A(MAOA)在同济队列2的肿瘤组织中表达水平较低。此外,同济队列中人类HCC组织中的5-HT浓度远高于邻近非肿瘤组织。总的来说,与非肿瘤组织相比,5-HT在HCC组织中通过内源性合成和外源性摄取积累。 图2 5-HT在HCC肿瘤组织中升高 二、TGM2水平升高预示HCC预后不良 TGM2可以通过5-HT介导蛋白质的5-羟色胺化,这一过程被归类为一种单胺化。为了确认TGM2在HCC中的表达模式,作者对HCC和邻近非肿瘤组织进行WB和HE染色。结果显示,与邻近非肿瘤组织相比,TGM2在HCC组织中的表达升高。此外,HCC组织中H3Q5ser水平也较高,并与TGM2表达相关。特别是H3K4me3Q5ser的修饰水平可能同时受到H3Q5ser和H3K4me3修饰改变的影响。由于H3Q5ser的丰度较低,在HCC组织中无法直接检测到H3Q5ser抗体。因此,作者测量了H3K4me3和H3K4me3Q5ser的水平,将标准化的H3K4me3Q5ser水平(相对于H3K4me3)作为H3Q5ser水平的间接指标。对临床样本的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)研究发现,TGM2表达较高的患者的OS和DFS较差,且TGM2表达与AFP水平升高、肿瘤分化较差、BCLC分期较晚呈正相关。较高的TGM2表达是较短OS和DFS的独立危险因素。综上所述,这些结果表明TGM2表达升高预示着较差的预后。 图3 TGM2的高表达与HCC的进展有关 三、在体外和体内,核定位的TGM2促进HCC的癌变和进展 为了确定TGM2在HCC癌变和进展中的功能,作者测量了7种肝癌细胞系中TGM2的核和细胞质蛋白水平,并建立了TGM2敲低和核特异性过表达的细胞系,随后,作者进行了CCK-8和集落形成实验来评估HCC细胞的增殖,Transwell和伤口愈合试验来评估HCC细胞的迁移和侵袭能力。结果显示,TGM2过表达可显著促进体外HCC细胞的增殖、迁移和侵袭;同样,TGM2过表达可显著促进皮下异种移植小鼠模型中HCC细胞的生长。此外,在HTVI模型中,TGM2促进了HCC的癌变和进展。这些结果表明,TGM2,特别是核定位的TGM2,在体外和体内促进HCC的癌变和进展。 图4 在小鼠模型中,Tgm2缺乏抑制HCC进展 四、TGM2通过其转谷氨酰胺酶活性介导的H3Q5ser修饰促进HCC进展 TGM2是谷氨酰胺转胺酶家族的一员,以其谷氨酰胺转胺酶活性而闻名。核定位的TGM2与H3Q5ser修饰密切相关。为了研究其转谷氨酰胺酶活性介导的H3Q5ser修饰在HCC进展中的作用,作者通过CRISPR-Cas9系统特异性敲除了TGM2,随后建立了过表达野生型TGM2或转谷氨酰胺酶活性缺陷突变变体(W241A)的HCC细胞系(两者都用核定位信号(NLS)标记),以及过表达野生型组蛋白H3.3和突变体(Q5A和Q5E)的HCC细胞系。CCK-8、集落形成实验以及皮下异种移植小鼠模型表明,谷氨酰胺转胺酶活性完整的TGM2过表达HCC细胞表现出最快的增殖。当H3.3在5位突变时,体外球体形成以及皮下异种移植小鼠模型中的肿瘤形成受到抑制。随后,作者在TGM2条件敲除(CKO)小鼠中建立了小鼠野生型TGM2或突变变体(W241A)模型的肝脏特异性过表达。HTVI实验表明TGM2过表达且谷氨酰胺转胺酶活性完好的模型肿瘤形成量最大,生存率最低。且突变5号位置的H3.3能够抑制肿瘤形成,提高生存率。总体而言,这些发现表明TGM2通过转谷氨酰胺酶活性介导的H3Q5ser修饰促进HCC进展。 图5 TGM2转谷氨酰胺酶活性介导的H3Q5ser修饰在体内促进HCC进展 五、H3Q5ser修饰增强MYC靶基因的转录 为了系统地研究TGM2介导的H3Q5ser修饰如何促进HCC进展,作者对H3K4me3和H3K4me3Q5ser进行了CUT&Tag测序,以分析它们在TGM2转谷氨酰胺酶活性抑制剂GK921处理的MHCC-97H细胞中的分布。测序分析显示,H3Q5ser修饰主要分布在启动子区域。抑制TGM2转谷氨酰胺酶活性导致TSS区域H3K4me3和H3K4me3Q5ser水平显著降低。GSEA显示,H3K4me3和H3K4me3Q5ser在参与肿瘤发生的几个关键信号通路中显著富集,包括MYC信号通路。这突出了TGM2介导的H3Q5ser修饰在HCC进展中的关键作用。此外,H3K4me3Q5ser修饰在PA2G4、LDHA、CCNA2、RFC4和SLC25A3的启动子上富集。随后,作者进行了转录组测序,GSEA分析显示,GK921处理后,MYC信号通路受到显著抑制。CUT&Tag和RNA测序的177个交集基因在所有样本中均与H3K4me3Q5ser(或H3K4me3)峰呈正相关。 为了确定核定位的TGM2介导的H3Q5ser修饰是否影响MYC信号通路,作者在TGM2或H3.3的肝脏特异性过表达的小鼠中检测了MYC关键靶基因的表达,并利用过表达野生型TGM2或突变变体(W241A)的细胞系进行了ChIP-qPCR验证。研究发现只有具有完整转谷氨酰胺酶活性的TGM2才会增加MYC靶基因上H3K4me3和H3Q5ser的水平。总之,这些发现表明核定位的TGM2介导的H3Q5ser修饰增强了MYC靶基因的转录。 图6 H3Q5ser修饰增强MYC靶基因的转录 六、TRIM28介导TGM2向MYC募集,通过H3Q5ser修饰促进MYC靶基因的转录 为了进一步研究TGM2转谷氨酰胺酶活性介导的H3Q5ser修饰如何调节MYC靶基因的表达,作者对MHCC-97H细胞中的TGM2进行了HuProt人类蛋白组芯片联合MS,发现TRIM28可能与TGM2结合并利用coIP进行了验证。分子对接结果表明,TRIM28介导了TGM2向MYC的募集,进一步的ChIP-qPCR分析表明TRIM28与MYC靶基因的启动子结合。 MYC靶基因上的H3K4me3和H3Q5ser水平因MYC或TRIM28敲低而下调。TRIM28敲低可降低MYC靶基因的转录,但不下调TGM2和MYC的表达。MYC敲低不影响TRIM28和TGM2在蛋白或mRNA水平上的表达。因此,TRIM28介导了TGM2对MYC信号通路的调节。 图7 TRIM28介导MYC募集TGM2,促进MYC靶基因上的H3Q5ser修饰 七、靶向TGM2转谷氨酰胺酶活性在临床前模型中抑制HCC进展 由于TGM2转谷氨酰胺酶活性在HCC进展中起重要作用,作者探索了其作为HCC治疗靶点的潜力。首先,研究确定了两种抑制剂Cystamine和GK921对H3K4me3和H3K4me3Q5ser的抑制作用。前者是谷氨酰胺转氨酶活性的泛抑制剂,而后者仅抑制TGM2谷氨酰胺转氨酶活性。两种抑制剂均在显著剂量下抑制H3K4me3Q5ser水平,在高剂量下抑制H3K4me3水平。CCK-8实验显示,这两种抑制剂在不同剂量下抑制HCC细胞增殖,且小鼠模型和人类HCC类器官模型表明GK921作为HCC治疗剂具有很大的潜力。此外,GK921与索拉非尼(一种现有的HCC治疗剂)有显著的协同作用。因此,靶向TGM2转谷氨酰胺酶活性,特别是联合索拉非尼是一种很有前景的HCC治疗策略。 图8 TGM2抑制剂与索拉非尼协同作用 IGENEBOOK 文章总结 TMG2表达与AFP水平升高、分化不良、BCLC分期较晚呈正相关。本文通过CUT&Tag联合RNA-seq测序技术,发现TGM2能够向MYC基因募集,促进H3Q5ser修饰MYC靶基因从而增强HCC进展。TGM2作为预后生物标志物,靶向其转谷氨酰胺酶活性可能是抑制HCC进展的有效策略。 CUT&Tag产品介绍 CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作的新兴实验方法,该方法是通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶在目标蛋白结合的DNA位置进行切割并且在序列两端加上测序接头,经过PCR扩增后形成可以用于高通量测序的文库,随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的DNA片段。 产品优势: 1. 无需甲醛交联,样本要求量低,背景干净,可重复性好; 2. 提供从方案设计,建库测序,到数据分析和验证一站式服务; 3. 云平台,多组学联合分析深度挖掘数据; 4. 项目经验丰富: · 实测数据:1. 抽核结果 提供“单细胞测序”标准的抽核解决方案。 2. CUT&Tag酶切片段分布 转录因子/组蛋白修饰的酶切片段分布呈现周期性。 3.reads密度分布图 reads在TSS附近呈现明显的富集。 4.功能元件分布图 Peak在基因功能元件上分布。 5.Peak可视化 ![]() 项目咨询 { 往 期 精 彩 回 顾 } 精选合集,欢迎收藏哟! |