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干货分享 | 细数新鲜冷冻（FF）样本的时空转录组全流程步骤时空转录组平台介绍 时空转录组技术利用纳米级芯片对组织和细胞原位捕获，以更高效率展开转录组扩增建库，同时捕获的空间位置信息能更好地对细胞类型特征“寻根问源”。从转录组、单细胞转录组再到时空转录组，测序获取的信息愈加丰富，对科学研究问题的解答愈有助益，时空转录组已成为热点技术之一。 时空转录组芯片上有纳米级小孔，每个小孔都有自己的“身份证”——空间坐标序列。空间坐标信息结合PolyT探针形成“抓手”，将贴到芯片上的组织各个区域mRNA捕获到各个小孔中，带有位置信息的mRNA逆转录成cDNA随后从芯片上释放，建库测序就能检测组织不同区域的转录组信息，并通过空间坐标序列识别到对应位置。 目前，爱基百客的时空转录组平台已搭建完成，可接受新鲜冷冻（Fresh Frozen, FF）OCT包埋样本和福尔马林固定石蜡包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded, FFPE）样本进行服务。两种组织样本前期包埋处理和后续时空实验差异较大，应用特点和适用组织类型也不同。新鲜冷冻（FF）样本的制备流程相对简单，能快速高效检测组织中细胞类型分布特点和转录组信息。下面将详细介绍新鲜冷冻（FF）样本的时空转录组全流程步骤以及关键要点。 组织包埋可直接影响切片效果，若OCT未完全包裹组织可能导致RNA降解，进一步影响切片质检和建库质量。根据已测试物种组织的切片经验，我们总结制作了新鲜样本OCT包埋视频，如有需要可咨询获取。 1. 人和动物组织包埋。对于常规器官和组织样本，按照我们的包埋视频制作OCT包埋块即可。但对于特殊质地或坚硬组织，需要经过前期组织处理。如含水量较多的组织用梯度蔗糖溶液浸透；易充血组织进行灌注除血；坚硬组织需脱钙处理再固定脱水。 常规组织OCT包埋需注意以下几点：
2. 植物组织包埋。植物外层表皮、韧皮部、木质部等组织在成熟时形成坚硬质地，因此做冰冻切片一般建议做幼嫩组织，但植物幼嫩组织可能过小，不满足切面占比，必要时可以多组织包埋。另外，植物组织形态各异，组织内部可能有各种空腔，导致切片破损，需抽泵处理使OCT填充孔隙。 植物多组织包埋需注意以下几点：
不同物种器官和组织的适宜切片温度不一样，需根据资料搜集和经验积累调整箱体温度。若对于组织切片结构组成有要求，需调整样本头的角度，将目标结构切到一个平面。爱基百客时空平台已积累一些物种组织切片经验，以下展示部分组织类型的切片白片效果图。
1. 切片RNA质检。组织修片和切片时将不完整或破损的切片收集起来，进行切片RNA质检。由于切片中组织含量较少，因此需用Trizol法或其他微量组织试剂盒抽提RNA。 核酸凝胶电泳。抽提的RNA进行电泳跑胶，常规组织有两条带，合格切片样本18S和28S条带完整且无降解；昆虫只有一条带，如家蚕、蜘蛛等。 片段大小分布检测。用Qsep仪器检测RNA的片段分布，计算28S/18S比值，即RIN值指标。合格切片样本RIN≥7，但昆虫RNA只有一个峰型，无法计算该指标。
2. 玻片H&E染色质检。H&E染色是指苏木精和伊红染色，是组织学检测常用的染色剂。苏木精染料呈深蓝紫色，是碱性染料，能与细胞核内的核酸结合；伊红染料呈红色，是酸性染料，与细胞质、细胞外基质中的蛋白质等物质结合。因此，H&E染色组织通过显微镜观察，细胞核呈蓝紫色，而细胞质、细胞外基质呈现不同程度的粉红色。 在开展时空转录组正式实验之前用玻片贴切片进行H&E染色质检，能确定组织和细胞形态是否正常，进一步确定用于正式实验的贴片区域。以下展示部分已测试物种组织的切片H&E染色图。
时空转录组实验中，组织切片贴到芯片上，需要将组织中的mRNA捕获到纳米孔中。但是，不同动物组织的细胞膜等结构、植物组织的细胞壁等结构阻碍核酸释放，透化试剂能分解这些结构，切片被透化后，组织各个区域的mRNA就被释放到芯片上的各个小孔中。需要注意的是，同一组织不同结构层的适宜透化时间不同，即使是同一包埋组织块的不同层切片的透化时间也可能不同，故每一个组织包埋块开展正式实验前都要进行组织透化测试，且应尽量减少切片损耗，使不同阶段实验所用切片结构状况相似，能互相对应。 连续切片4张，贴于透化芯片，设置四个梯度的透化时间进行透化测试。在透化-反转录-组织移除结束后，保持相同拍照参数进行拍照成像，对比荧光成像效果判断最佳透化时间。如以下人皮肤黑色素瘤透化测试从左到右设置28-24-18-12min，结果显示透化少于18min，部分区域无荧光信号；透化24min时形态完整、各层结构信号均匀；透化28min时荧光信号减弱。综合以上结果，确定24min是最佳透化时间。
人皮肤黑色素瘤透化时间测试 组织包埋块修片尽量减少损耗，修出完整组织时切片，将前期选定的区域贴于芯片上。将该芯片进行ssDNA或H&E染色后拍照，留存这张用于正式实验的切片染色图。成像图质检通过后按照最佳透化时间透化，将捕获的mRNA进行反转录反应，扩增纯化即可获得cDNA中间产物。合格的cDNA富集产物峰型分布在200-2000bp左右，产量大于100ng。下图是一个合格的cDNA产物片段大小分布图。
用合格的cDNA产物进行PCR扩增，纯化后即可获得时空转录组文库。合格的文库片段分布在100-1000bp，主峰在200-600bp范围，产量大于100ng。下图是一个合格文库片段大小分布图。
IGENEBOOK 结 语 在新鲜冰冻（FF）样本的时空转录组全流程实验中，在每个阶段我们会进行相应质检，结果以报告形式反馈。切片图数据量过大，如需原图可联系公司人员进行返图。
切片结果图片—白片 切片结果图片—玻片H&E染色图 RNA质检报告—切片抽提RNA电泳图、片段大小分布图 cDNA质检报告—时空转录组cDNA片段大小分布图、浓度总量等详细信息 文库质检报告—文库片段大小分布图、浓度总量等详细信息
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