项目文章|Klotho通过抑制ERK1/2和Wnt/β-连环蛋白信号通路减轻视网膜色素上皮细胞在视网膜下纤维化中的上皮-间质转化

昆明医科大学第一附属医院李燕教授团队发表文献“Klotho attenuates epithelial‑mesenchymal transition of retinal pigment epithelial cells in subretinal fibrosis by suppressing the ERK1/2 and Wnt/β‑catenin signaling pathways”。本研究探讨了抗衰老蛋白Klotho在调节视网膜色素上皮细胞（RPE）上皮-间质转化（EMT）和抑制激光诱导小鼠脉络膜新生血管（CNV）导致的视网膜下纤维化中的作用机制。通过体外实验发现，Klotho过表达能够逆转转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的EMT（上皮-间质转化），并通过抑制ERK1/2和Wnt/β-连环蛋白信号通路显著减少细胞迁移和增殖能力。体内实验显示，玻璃体内注射Klotho蛋白显著减少小鼠视网膜下纤维化面积，降低纤维化相关标志物表达。研究表明，Klotho通过调控ERK1/2和Wnt/β-连环蛋白信号通路，可能成为治疗老年性黄斑病变（nAMD）相关纤维化性玻璃体视网膜病变的潜在治疗方法。其中爱基百客为此研究提供了RNA-seq技术服务。

TGF‑β1是纤维化的重要介质。在本研究中，使用TGF‑β1诱导EMT形成纤维化细胞模型。经过10ng/ml TGF‑β1处理48h，ARPE‑19细胞从短梭形的卵石样形态转变为细长的梭形，并呈现涡流状的增殖生长（图1A）。蛋白质印迹（Western Blot ，WB）结果显示，TGF‑β1处理导致间质标志物（α‑SMA、N‑cadherin和I型胶原）的表达上调，同时伴随着上皮标志物ZO‑1表达的下调（图1B和C）。此外，CCK‑8和EdU检测结果表明，TGF‑β1处理显著增强了细胞的增殖能力（图1D‑F）。划痕愈合实验和Transwell实验结果也显示，TGF‑β1显著促进了ARPE‑19细胞的迁移（图1G‑J）。数据表明，用10ng/ml的TGF‑β1处理ARPE‑19细胞48小时能够有效诱导EMT发生。同时，RT‑qPCR和WB数据显示，在TGF‑β1处理的细胞中，Klotho的mRNA和蛋白表达水平显著降低（图1K‑M）。

图1. TGF‑β1诱导ARPE‑19细胞发生EMT并下调Klotho的表达

由于在TGF‑β1处理的ARPE‑19细胞中，Klotho的表达显著下调，因此将Klotho过表达后，继续后续验证。荧光显微镜显示慢病毒的转染效率。通过WB检测EMT标志物的表达。Klotho过表达逆转了TGF‑β1诱导下上皮标志物ZO‑1的减少以及间质标志物（α‑SMA、N‑cad和I型胶原）的增加（图2A‑E）。

CCK‑8和EdU实验结果表明，TGF‑β1促进了ARPE‑19细胞的增殖，而这种增殖的增加在Klotho过表达后被减弱（图2F‑H）。划痕愈合实验和Transwell实验显示，TGF‑β1处理组细胞迁移能力增强，而Klotho过表达逆转了这一效应（图2I‑L）。这些数据表明，Klotho的过表达能够缓解TGF‑β1诱导的ARPE‑19细胞EMT。

RT‑qPCR结果显示，Klotho过表达后，其mRNA水平增加了≥2,000倍（图3A）；WB结果显示，Klotho蛋白表达水平增加了19倍（图3B和C）。

图2. Klotho过表达能够减轻由TGF‑β1诱导的ARPE‑19细胞的EMT

在证明Klotho过表达能够缓解TGF‑β1诱导的ARPE‑19细胞EMT后，本研究进一步评估了Klotho敲低是否会导致细胞的间质性转分化。通过慢病毒质粒进行小发夹RNA（shRNA）介导的Klotho敲低实验。RT‑qPCR结果显示Klotho基因被有效敲低（图3D）。

WB结果显示，与对照小组（sh-NC组）相比，Klotho敲低显著增加了间质标志物（α‑SMA、N‑cad和I型胶原）的表达，同时降低了上皮标志物ZO‑1的表达（图3E和F）。

图3. 敲低Klotho会诱导ARPE-19细胞发生EMT

为了研究Klotho过表达后信号通路活性变化，通过RNA-seq分析比较了Lv‑klotho组和Lv‑NC组之间的基因表达差异。在RNA-seq分析中，差异表达基因（DEGs）的热图显示了两组之间显著的差异。在DEGs火山图（图4B）中，Lv‑klotho组相比Lv‑NC组共鉴定出1,374个差异表达基因，其中669个基因上调，705个基因下调。

GO富集分析显示，“细胞迁移的正调控”、“细胞运动的正调控”、“对细胞因子的反应”、“运动的正调控”和“细胞成分运动的正调控”等过程下调，而“细胞增殖的负调控”、“细胞粘附的负调控”、“T细胞介导的免疫调节”和“血管形态发生”等过程上调（图4C）。

通过KEGG分析，鉴定出18条显著富集的通路（图4D），其中包括“TNF信号通路”、“细胞衰老”、“AGE‑RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用”以及“MAPK信号通路”等通路。

图4. Klotho过表达后的RNA-seq分析

Wnt/β‑catenin信号通路和MAPK（ERK1/2）通过与TGF‑β信号通路的互作促进EMT。而据报道，Klotho可以抑制这些通路，从而抑制EMT。此外，RNA-seq的结果表明，Klotho过表达下调了MAPK信号通路。因此，研究进一步评估了这些信号通路是否受到TGF‑β1处理或Klotho过表达的影响。

WB实验表明，TGF‑β1增强了ERK1/2的磷酸化水平，而Klotho的过表达显著逆转了这一作用（图5A和B）。此外，Klotho过表达也逆转了TGF‑β1诱导的Wnt/β‑catenin信号通路的激活表现（通过c‑Myc、cyclin D1和β‑catenin的表达水平进行检测）（图5C‑F）。

综上所述，这些研究结果表明，Klotho的过表达通过抑制Wnt/β‑catenin和ERK1/2信号通路，防止了ARPE‑19细胞发生EMT。

图5. Klotho通过ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路调控ARPE-19细胞的EMT

在6～8 周龄的雄性小鼠中，通过激光照射诱导形成视网膜下纤维化。激光处理后，利用眼组织切片的 Masson 染色（观察胶原沉积）以及 RPE‑脉络膜‑巩膜平铺标本的 I 型胶原免疫荧光染色，可明显检测到纤维化的形成。未接受激光处理的小鼠作为正常对照组，其 RPE 结构完整且分层清晰，未见视网膜下纤维化病灶，因而无法用于纤维化面积的比较。接受激光诱导但仅用 PBS 处理的小鼠则作为空载对照组，用于后续实验对比。

为探讨Klotho对视网膜下纤维化的潜在影响，于激光手术后第3天向CNV小鼠玻璃体腔注射重组Klotho蛋白（1 µl）。玻璃体内注射后第4天（即光凝术后第7天），收集眼组织进行进一步检测。免疫荧光染色结果显示，Klotho显著减小了视网膜下纤维化的面积（图6A和B）。使用10nM和20nM的Klotho，与30nM相比抗纤维化效果显著（图6A）。最终选择10nM用于后续实验。Masson染色结果进一步显示，与空载对照组相比，10nM Klotho处理组的视网膜下胶原沉积显著减少（图6C和D）。

图6. Klotho在脉络膜新生血管小鼠模型中减缓了视网膜下纤维化的进程

为了检测Klotho治疗组和空载组之间EMT相关蛋白水平的差异，进行了针对RPE65（视网膜色素上皮细胞标志物）和α‑SMA的抗体免疫荧光染色。结果显示，与空载组相比，Klotho（10 nM）处理的小鼠在视网膜下纤维化病灶区域中α‑SMA的蛋白水平较低（图6E）。

随后，对来自RPE‑脉络膜‑巩膜复合体的蛋白进行WB检测。结果发现，与空载组相比，Klotho显著抑制了α‑SMA、N‑cadherin和I型胶原的表达，同时增加了ZO‑1的表达（图6F‑J）。这些结果表明，Klotho在体内抑制了视网膜下纤维化。

接下来，评估了Klotho是否通过调控ERK1/2和Wnt/β‑catenin信号通路抑制了小鼠RPE细胞的EMT过程。WB结果显示，Klotho显著抑制了ERK1/2的磷酸化以及Wnt/β‑catenin通路的激活（图7A‑F）。

图7. Klotho通过ERK1/2和Wnt/β‑catenin信号通路在体内减缓了视网膜下纤维化的进程

该研究通过体外和体内实验探讨了Klotho蛋白在视网膜下纤维化中的抗纤维化作用及机制。体外实验利用TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT，发现Klotho过表达显著抑制EMT相关标志物（如ZO-1、α-SMA、N-cadherin）的变化，并减弱细胞增殖和迁移能力。RNA-seq表明Klotho通过调控TNF、MAPK等信号通路，下调迁移相关基因，抑制ERK1/2和Wnt/β-catenin信号。体内实验验证，Klotho显著减少小鼠视网膜纤维化区域并降低相关蛋白表达。总之，研究表明Klotho通过抑制ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路，发挥了抗纤维化作用，为治疗nAMD相关的视网膜下纤维化提供了新的潜在靶点和思路。

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