项目文章 | Redox Biology组蛋白乳酸化在肝癌微波消融术后转移中的作用机制

组蛋白乳酸化是近年来在表观遗传学领域受到广泛关注的新兴修饰。它是指乳酸基团通过酰化反应与组蛋白上的赖氨酸残基结合形成的修饰。酰化通常发生在某些条件下，例如低氧或代谢状态变化。研究发现代谢产物乳酸的积累能够通过酰化反应直接修饰组蛋白，调节基因表达。组蛋白乳酸化的异常与多种疾病（如癌症、代谢疾病和免疫疾病）相关联。这一研究方向也备受国自然和顶刊的青睐。本期，我们带来了一篇组蛋白乳酸化ChIP-seq的项目文章，带大家了解这一研究思路。

2025年2月15日，四川大学华西医院的卢强教授团队在期刊Redox Biology（IF=10.7）发表题为“Histone lactylation drives liver cancer metastasis by facilitating NSF1-mediated ferroptosis resistance after microwave ablation”的研究论文。该研究主要探讨了组蛋白乳酸化在肝癌微波消融术后转移中的作用机制，并揭示了其通过调控NFS1介导的铁死亡抵抗促进肿瘤进展的分子通路。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。

为了确定异常糖酵解是否参与了亚致死HS诱导的肝细胞癌进展，研究对已建立的亚致死HS细胞模型进行了转录组测序分析。基于基因表达数据、GO和KEGG分析，揭示了糖酵解在HCC癌变中的关键作用，并提示它可能介导亚致死HS下HCC的进展。另外，结合GEO数据库更进一步证明了糖酵解在HCC中的作用。

为了更详细地说明HS下HCC的代谢重编程，研究生成了KEGG通路热图，以可视化亚致死HS的HCC细胞中糖酵解/糖异生通路的单个基因表达变化。HS处理的HCC细胞中限速酶HK1和PFKL的表达上调，这一结果通过RT-qPCR得到了验证。为了研究HK1和PFKL在HCC进展中的作用，研究使用临床HCC样本评估了它们的预后价值。

图：亚致死热应激（HS）增加了HCC中的糖酵解

为了探讨亚致死HS对肝癌细胞的影响，研究对MHCC-97H和Huh7细胞系进行了处理，然后进行CCK-8实验和Transwell实验。为了验证亚致死HS条件下体内致癌功能，研究使用了尾静脉注射裸鼠模型，随后进行H&E染色、WB和免疫荧光分析。这些实验结果表明HS促进了肝癌细胞的转移能力。

Warburg效应以糖酵解增强和乳酸水平升高为特征，是HCC的标志性特征。已有报道称，亚致死HS可触发HCC细胞中的Warburg效应增强，研究团队推测乳酸驱动了转移潜能的增加。在47°C或37°C水浴处理24h后，测量了细胞内乳酸水平。研究观察到，亚致死HS处理的HCC细胞中乳酸水平显著增加。相反，当使用糖酵解抑制剂处理时，乳酸生成显著减少（图2E）。为了评估乳酸水平对HCC细胞转移的影响，研究通过使用糖酵解抑制剂处理HCC细胞24h来降低细胞内乳酸浓度。乳酸生成的抑制逆转了HS处理细胞中观察到的迁移和侵袭能力的增强（图2F、G）。

为了评估乳酸在HCC细胞转移中的作用，研究用不同浓度的乳酸处理HCC细胞48h，以研究其对细胞的直接影响。无论是否进行亚致死性HS处理，乳酸均以剂量依赖性方式增强了细胞的迁移和侵袭能力（图2I-K）。乳酸脱氢酶A（LDHA）是糖酵解最后一步中催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶。研究将细胞中的LDHA沉默后，观察表型和功能。这些结果表明，亚致死性HS以乳酸依赖的方式促进了HCC细胞的转移。

图：亚致死HS以乳酸依赖的方式促进HCC细胞转移

已有报道显示，乳酸可以通过组蛋白乳酸化调节表观遗传修饰，促进HCC的进展。为了研究亚致死HS对乳酸化的影响，研究评估了肝癌细胞中多个组蛋白位点的乳酸化水平。WB结果显示，在七个组蛋白乳酸化位点中，H3K18la在暴露于亚致死HS的HCC细胞中显著增加（图3A）。然后，研究分别对细胞进行了不同时间点和不同浓度乳酸的处理。乳酸水平以及H3K18la在HCC细胞中经过24h的亚致死HS处理后显著增加（图3B-D）。研究观察到，在相同乳酸浓度下，经过HS处理的HCC细胞比对照HCC细胞表现出更高的H3K18la表达（图3E）。此外，乳酸抑制剂对细胞内乳酸生成的抑制抵消了亚致死HS在肝癌细胞中增加H3K18la表达的能力（图3F）。

为了确认细胞内乳酸水平与H3K18la表达之间的联系，研究评估了LDHA沉默的肝癌细胞中的H3K18la水平。Western blot分析显示，通过shLdha抑制乳酸生成显著逆转了亚致死HS诱导的H3K18la表达上调。此外，通过免疫组化（IHC）在细胞来源的异种移植小鼠模型中验证了H3K18la表达的上调（图3H）。为了验证IMWA在肝癌中的功能作用，研究进行了队列回顾性研究。IHC染色显示，IMWA后复发的肝癌组织中H3K18la水平显著高于手术切除后的组织（图3I）。这些数据表明，IMWA后的肝癌以H3K18la表达上调为特征。从表观遗传学的角度来看，H3K18la在启动子区域的表达和富集增加可能在驱动靶基因表达中起关键作用（图3J）。

图：亚致死HS促进H3K18la在HCC中的表达

为了全面阐明亚致死HS、乳酸和H3K18la促进肝细胞癌进展的机制，研究采用了多组学方法（转录组+蛋白组+ChIP-seq）来探索功能性候选基因（图4A）。首先，研究对转录组和蛋白质组数据进行了联合分析，以识别受亚致死性HS影响的标志性生物标志物和通路。在9697个蛋白质编码转录本中，共有7752个在蛋白质水平上被检测到，表明蛋白质组数据集具有全面的覆盖范围（图4B）。相关性分析显示，mRNA的表达与蛋白质表达呈正相关（图4C）。研究鉴定出与细胞内铁离子稳态的生物学过程相关的基因。同样，涉及铁离子结合分子功能的基因在HS处理的HCC细胞中也显著富集（图4D）。KEGG通路分析显示，铁死亡通路在代表性上调的差异表达基因（DEGs）中显著富集（图4E）。值得注意的是，与铂类药物耐药相关的基因在转录组和蛋白质组数据库中均显著富集（图4E和F）。

已有报道显示对铁死亡的抵抗在结直肠癌对铂类药物的化疗耐药中起着关键作用。为了研究抗铁死亡和铂耐药是否参与亚致死HS肝细胞癌的进展，研究检索了公共铁死亡基因数据库FerrDb，并利用转录组和蛋白质组数据进行了整合分析。在绝对皮尔逊相关系数（CCs）超过0.5的基因中，代表性的抗铁死亡基因SLC7A11和GSS在RNA和蛋白质表达水平之间表现出负相关。此外，铁硫簇合成基因ISCU和NFS1以及核心抗铁死亡基因GPX4的RNA和蛋白质表达之间观察到正相关（图4G）。

为了确定H3K18la的潜在功能，使用抗H3K18la抗体进行了ChIP-seq以鉴定候选基因。在HS组中鉴定了1050个增加的H3K18la结合峰，其中4.51%（47个上调基因）位于启动子序列（图4H）。KEGG分析显示，亚致死HS组中上调的基因在癌症转移相关通路中富集（图4I）。此外，研究分析了转录组、蛋白质组和ChIP-seq数据库中的重叠上调基因，并鉴定了11个候选基因（图4J）。随后，研究验证了这些基因以及代表性铁死亡基因的表达。值得注意的是，NFS1的表达显著上调（图4K和L）。此外，ChIP-seq数据显示，在HS处理的HCC细胞中，H3K18la在NFS1的启动子区域富集（图4M）。然而，H3K18la在其他铁死亡基因的启动子区域并未显著富集。

图：H3K18a驱动NFS1表达上调，抑制热处理HCC细胞的铁死亡

RT‒qPCR和Western blotting证实，在亚致死HS处理的HCC细胞中，NFS1的表达增加（图5A和B）。研究使用HCC CDX小鼠模型和临床样本进行了IHC染色，结果显示在IMWA后，NFS1的表达显著上调（图5C和D）。为了阐明乳酸诱导的NFS1过表达之间的联系，HCC细胞分别用0、5或10 mM乳酸孵育2天。正如预期的那样，乳酸处理显著增加了NFS1的表达（图5E）。此外，在37°C和47°C处理的HCC细胞中，LDHA的耗竭降低了NFS1的表达（图5F）。综上所述，细胞内乳酸水平对NFS1的表达有显著影响。

NFS1对于转移性肺肿瘤的启动至关重要。因此，研究NFS1是否也在介导肝癌细胞的转移潜能中发挥作用。在MHCC-97H和Huh7细胞中沉默NFS1。免疫荧光染色和流式细胞术分析表明，NFS1的抑制显著损害了HCC细胞的活力，不仅影响了在47°C处理的细胞，也影响了在37°C维持的细胞（图5H）。Transwell实验表明沉默NFS1减弱了亚致死HS诱导的HCC细胞转移潜能的增加（图5I）。在尾静脉注射动物模型中，NFS1敲低减少了HS处理和未处理的MHCC-97H细胞的肺转移（图5J和K）。为了研究NFS1对上皮间质转化（EMT）潜能的影响，通过Western blot分析检测了有或无HS处理的HCC细胞中EMT标志物的表达。沉默NFS1后，N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达显著降低；而E-钙黏蛋白的表达未见明显变化（图5L）。这些发现共同表明，NFS1表达的下调有效阻断了亚致死HS诱导的HCC转移。

图：亚致死HS下的HCC转移需要NFS1

为了阐明NFS1促进HS HCC转移的机制，研究了NFS1缺失导致的功能变化。shNC和shNfs1在HS处理的HCC细胞之间的基因谱存在显著差异（图6A-C）。GO分类中的下调基因在细胞运动和细胞骨架组装相关term中显著受到抑制（图6D）。此外，在NFS1沉默的情况下，亚致死HS处理的HCC细胞表现出药物代谢能力受损（图6E）。值得注意的是，NFS1缺失减弱了与铂耐药性和应激反应相关基因的表达（图6F）。

NFS1在铁硫簇的生物合成中起着关键作用；正如预期，抑制NFS1显著阻碍了参与2铁2硫簇结合的基因的激活（图6G）。研究评估了在shNC和shNfs1转染的HCC细胞中，无论是否进行亚致死HS处理，GPX4和ATF4（铁死亡标志物）的表达情况。免疫印迹结果显示，无论NFS1是否被抑制，GPX4在热处理的Huh7细胞中均过表达。在NFS1缺失或HS处理后，HCC细胞中ATF4的表达上调。此外，研究还比较了在有无HS处理下，shNC和shNfs1 HCC细胞中关键铁死亡相关基因的表达水平。

线粒体的代谢活动，包括三羧酸循环和线粒体电子传递链的活性，对于生成足够的脂质活性氧（ROS）以启动铁死亡是不可或缺的。铁死亡的发生伴随着线粒体功能的受损，其特征是ATP合成和膜电位的降低。研究采用多种实验评估Nfs1基因沉默对MHCC-97H细胞表型的多方面影响，包括线粒体功能（线粒体膜电位）、线粒体形态（电子显微镜观察）、ROS水平（C11-BODIPY染色）、脂质过氧化损伤（丙二醛（MDA）水平）。基因集富集分析表明与细胞对有毒物质反应相关的基因在亚致死性HS HCC细胞中被发现受损，这一结果与上述发现一致。此外，NFS1沉默后，细胞运动和转移相关基因表达下调。

图：NFS1表达的上调降低了亚致死HS后对铁死亡的易感性

通过FerroOrange染色评估了细胞内的总Fe²⁺水平。与保持在37°C的细胞相比，暴露于亚致死HS的肝癌细胞表现出较低的细胞内亚铁水平。相反，shNfs1组无论是否接受HS处理，均表现出较高的细胞内亚铁水平（图7A）。为了研究NFS1对肝癌细胞的协同影响，对亚致死热处理的MHCC-97H细胞进行了5 μM OXA处理。免疫荧光染色结果显示，单独使用OXA处理并未显著增加脂质ROS水平，而OXA与Nfs1联合敲低处理则使脂质ROS水平增加了2.4倍（图7B）。

为了确定联合治疗的优越抑制效果，分别在体外和体内评估了肝癌细胞的转移潜能。Transwell实验表明，OXA适度抑制了HCC细胞的迁移和侵袭能力。然而，与NFS1缺陷相结合时，OXA处理显著削弱了HCC细胞的转移潜能，无论是否暴露于亚致死性HS。（图7C）。此外，通过尾静脉向每只小鼠注射转染了shNC或shNfs1的MHCC-97H细胞，建立了动物模型。每三天腹腔注射一次OXA，剂量为7.5 mg/kg，直至第30天（图7D）。在shNC组中，即使在OXA给药后，仍观察到HS对HCC细胞肺转移的促进作用。然而，敲低NFS1显著减少了肺转移，无论是否存在HS（图E-G）。综上所述，数据表明，NFS1敲低与OXA治疗在抑制HCC转移方面具有显著的协同效应（图7H）。

图：NFS1敲低增强了奥沙利铂（OXA）治疗对HCC转移的抑制作用

研究调查了H3K18la、NFS1和波形蛋白在临床HCC样本中的表达。原发性HCC经微波治疗后怀疑为原位复发，随后经手术切除，组织病理学证实为复发性HCC（图8A）。通过IF染色，研究观察到IMWA后复发的HCC组织中H3K18la、NFS1和波形蛋白的水平高于手术切除的HCC组织（图8b和C）。

图：H3K18/NFS1通路介导了亚致死HS后HCC细胞转移能力的增加

研究结果表明，NFS1可能成为以OXA为基础的化疗在肝细胞癌治疗中的一个有前景的治疗靶点。研究证明了亚致死性热休克通过诱导H3K18la修饰介导的NFS1表达上调，降低了HCC细胞对铁死亡的易感性，从而促进了HCC的转移。在体内和体外，沉默NFS1协同增强了OXA治疗HCC的效果（图8D）。进一步的研究对于填补现有知识空白和加深我们对相关机制的理解至关重要。

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