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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),位于武汉高农生物园,办公面积逾3000平方米,是一家专业提供单细胞与空间组学测序分析、表观组学科研服务和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。

公司旨在为客户提供最专业的科研服务,运营至今合作的科研客户近千家,涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业,运营至今销售额超1亿元,科研成果曾多次在Science、Cancer Cell、Plant Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL等国际高水平学术期刊发表,受到了客户广泛好评,是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。

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表观组学ChIP-seq/CUT&Tag/ATAC-seq等技术样本制备指南,你学废了吗?


样本质量作为组学研究的“第一公里”,是影响数据可靠性和准确性的关键因素。

不同组学技术对样本质量的要求各异,而样本的采集、保存、处理等环节中的任何偏差都可能导致数据偏差或错误结论。有研究表明RNA降解导致转录组3'端偏好性偏差高达70%,单细胞测序中,细胞活率<80%时,基因检出数下降40%以上,表观组样本中甲醛交联过度,ChIP-seq信号丢失50%……这就是为什么同样的实验流程,有人发高分文章,有人数据全废?答案可能藏在样本处理的第一步!

本期,我们将介绍表观组学ChIP-seq/CUT&Tag/ATAC-seq技术样本质量的“隐形杀手”和破解之道。


指标一
细胞(核)状态


  • 理想标准

细胞:死细胞率<10%

细胞核:细胞核完整性好

有核率>85%,台盼蓝染色均匀

  • 常见问题

ChIP-seq/ATAC-seq/CUT&Tag:死细胞释放的DNA酶会降解染色质,导致背景噪音升高

Hi-C:死细胞的染色体断裂,降低有效互作信号

  • 主要原因分析

细胞活率较差,细胞核不完整,样本处理延迟、培养条件不稳定(如pH、温度波动)

应激:改变染色质开放状态

  • 解决方案

避免使用冻存细胞,保证细胞活率

全程冰上操作

优化细胞核提取方案

应激状态最小化(培养、处理条件)

  • 验证/补救方法

细胞分析仪对总量及活率进行质检

磁珠或流式分选

应激标记物检测

指标二
样本交联条件


  • 理想标准

靶标区域富集效率最适条件

  • 常见问题

ChIP-seq:

(1)抗体无法有效捕获蛋白-DNA复合物,导致信号弱或假阴性

(2)染色质难以片段化,抗体结合位点被掩盖

Hi-C:

(1)染色质三维结构未固定,随机断裂后互作信号丢失

(2)交联过密,酶切效率下降,样本内部交联不彻底,导致数据异质性

  • 主要原因分析

交联不足:可能导致蛋白质和DNA解离,从而影响富集效率。

交联过度:会显著降低染色质超声破碎效率,导致片段化过长,背景噪音高,且可能遮蔽ChIP抗体识别的表位。

交联不均:会导致在后续的染色质免疫沉淀等步骤中,不同区域的蛋白质-DNA复合物的富集效率不同。一些区域的复合物可能交联过度,难以被有效分离和富集;而另一些区域的复合物交联不足,容易在操作过程中丢失,从而影响最终的实验结果,使得到的蛋白质-DNA结合位点信息不准确、不全面,出现假阴性或假阳性结果。

  • 样本解决方案

新样本类型,需测试不同交联条件

ChIP-seq:1%甲醛,室温10-30分钟,交联后立即用甘氨酸终止

Hi-C:1%甲醛,室温10分钟,交联后需彻底裂解细胞

  • 验证/补救方法

染色质片段化检测:凝胶电泳/Bioanalyzer检查染色质片段大小分布

交联效率检测:qPCR验证靶标区域富集效率

指标三
染色质状态


  • 理想标准

保持染色质的完整性、正常的开放程度和凝聚程度

  • 常见问题

ATAC-seq中开放染色质信号弱

核小体信号模糊

ChIP-seq信噪比低

Hi-C数据稀疏,有效互作对少

  • 主要原因分析

提取方法不当、保存条件不佳

样本基因组或者自身处理状态导致存在大量高度凝聚的异染色质或重复片段,难以被Tn5或DNase I切割,导致数据覆盖不均

MNase/Tn5过度消化导致单核小体(147 bp)信号过强,丢失长范围信息

染色质片段化不合适

染色质交联不均或酶切不完全

  • 样本解决方案

ATAC-seq和Hi-C需活细胞,避免冻存降解

优化细胞核提取及酶切条件

超声/MNase后必须电泳检测,避免盲目下游实验

  • 验证/补救方法

片段大小:凝胶电泳/Bioanalyzer检查染色质片段大小分布

开放信号:FastQC(片段分布)

Hi-C互作:HiC-Pro软件分析

指标四
富集效率


  • 理想标准

满足样本与抗体的适用性、确保富集效率的灵敏度

  • 常见问题

低信噪比

异常peak

无显著富集峰

重复性差

  • 主要原因分析

抗体特异性不足

抗体效价降低

交叉反应

交联对抗体表位的影响

染色质片段化过度

洗涤条件过严

靶蛋白低表达

产品自身因素无法满足高信噪比或重复性

  • 样本解决方案

优先选择ENCODE验证过的抗体及ChIP-grade认证抗体

实验优化交联及片段化条件

抗体保存优化

使用Protein A/G磁珠预清除非特异结合

Ultra-low input ChIP优化

合并多次IP产物

换做N-ChIP或其他无需交联的产品

  • 验证/补救方法

IGV可视化分析

ChIP-qPCR或其他验证手段:阳性/阴性对照

这份提升样本质量的指南,你学废了吗?

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