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表观组学ChIP-seq/CUT&Tag/ATAC-seq等技术样本制备指南,你学废了吗?样本质量作为组学研究的“第一公里”,是影响数据可靠性和准确性的关键因素。 不同组学技术对样本质量的要求各异,而样本的采集、保存、处理等环节中的任何偏差都可能导致数据偏差或错误结论。有研究表明RNA降解导致转录组3'端偏好性偏差高达70%,单细胞测序中,细胞活率<80%时,基因检出数下降40%以上,表观组样本中甲醛交联过度,ChIP-seq信号丢失50%……这就是为什么同样的实验流程,有人发高分文章,有人数据全废?答案可能藏在样本处理的第一步! 本期,我们将介绍表观组学ChIP-seq/CUT&Tag/ATAC-seq技术样本质量的“隐形杀手”和破解之道。
细胞:死细胞率<10% 细胞核:细胞核完整性好 有核率>85%,台盼蓝染色均匀
ChIP-seq/ATAC-seq/CUT&Tag:死细胞释放的DNA酶会降解染色质,导致背景噪音升高 Hi-C:死细胞的染色体断裂,降低有效互作信号
细胞活率较差,细胞核不完整,样本处理延迟、培养条件不稳定(如pH、温度波动) 应激:改变染色质开放状态
避免使用冻存细胞,保证细胞活率 全程冰上操作 优化细胞核提取方案 应激状态最小化(培养、处理条件)
细胞分析仪对总量及活率进行质检 磁珠或流式分选 应激标记物检测
靶标区域富集效率最适条件
ChIP-seq: (1)抗体无法有效捕获蛋白-DNA复合物,导致信号弱或假阴性 (2)染色质难以片段化,抗体结合位点被掩盖 Hi-C: (1)染色质三维结构未固定,随机断裂后互作信号丢失 (2)交联过密,酶切效率下降,样本内部交联不彻底,导致数据异质性
交联不足:可能导致蛋白质和DNA解离,从而影响富集效率。 交联过度:会显著降低染色质超声破碎效率,导致片段化过长,背景噪音高,且可能遮蔽ChIP抗体识别的表位。 交联不均:会导致在后续的染色质免疫沉淀等步骤中,不同区域的蛋白质-DNA复合物的富集效率不同。一些区域的复合物可能交联过度,难以被有效分离和富集;而另一些区域的复合物交联不足,容易在操作过程中丢失,从而影响最终的实验结果,使得到的蛋白质-DNA结合位点信息不准确、不全面,出现假阴性或假阳性结果。
新样本类型,需测试不同交联条件 ChIP-seq:1%甲醛,室温10-30分钟,交联后立即用甘氨酸终止 Hi-C:1%甲醛,室温10分钟,交联后需彻底裂解细胞
染色质片段化检测:凝胶电泳/Bioanalyzer检查染色质片段大小分布 交联效率检测:qPCR验证靶标区域富集效率
保持染色质的完整性、正常的开放程度和凝聚程度
ATAC-seq中开放染色质信号弱 核小体信号模糊 ChIP-seq信噪比低 Hi-C数据稀疏,有效互作对少
提取方法不当、保存条件不佳 样本基因组或者自身处理状态导致存在大量高度凝聚的异染色质或重复片段,难以被Tn5或DNase I切割,导致数据覆盖不均 MNase/Tn5过度消化导致单核小体(147 bp)信号过强,丢失长范围信息 染色质片段化不合适 染色质交联不均或酶切不完全
ATAC-seq和Hi-C需活细胞,避免冻存降解 优化细胞核提取及酶切条件 超声/MNase后必须电泳检测,避免盲目下游实验
片段大小:凝胶电泳/Bioanalyzer检查染色质片段大小分布 开放信号:FastQC(片段分布) Hi-C互作:HiC-Pro软件分析
满足样本与抗体的适用性、确保富集效率的灵敏度
低信噪比 异常peak 无显著富集峰 重复性差
抗体特异性不足 抗体效价降低 交叉反应 交联对抗体表位的影响 染色质片段化过度 洗涤条件过严 靶蛋白低表达 产品自身因素无法满足高信噪比或重复性
优先选择ENCODE验证过的抗体及ChIP-grade认证抗体 实验优化交联及片段化条件 抗体保存优化 使用Protein A/G磁珠预清除非特异结合 Ultra-low input ChIP优化 合并多次IP产物 换做N-ChIP或其他无需交联的产品
IGV可视化分析 ChIP-qPCR或其他验证手段:阳性/阴性对照 这份提升样本质量的指南,你学废了吗? 项目咨询 { 往 期 精 彩 回 顾 } 精选合集,欢迎收藏哟! |