如何制备动物组织单细胞悬液，从经验积累到标准化操作全解析

在单细胞测序、细胞功能研究等前沿领域中，高质量单细胞悬液的制备是实验成功的关键前提。作为深耕生命科学技术服务多年的团队，我们已累计完成几千例动物组织单细胞悬液解离项目，覆盖人、小鼠、大鼠、猪、猴等20余种动物物种，涉及脑、肺、肝脏、肾脏、肿瘤等50+组织类型。本方法基于组织特性差异，结合机械解离与酶解技术，旨在提供标准化的动物组织单细胞悬液制备流程。以动物实体组织（如肝脏、肿瘤）为例，单细胞悬液制备的方法步骤如下：

1、材料：

目标动物组织（新鲜获取，置于预冷的组织保存液中保存）。

2、试剂：

消化酶（如胶原酶、胰蛋白酶、DNase I，根据组织类型选择）、胎牛血清（FBS）、PBS缓冲液、RPMI 1640培养基、AOPI、台盼蓝染色液。

3、实验器材：

眼科剪、镊子、培养皿、细胞筛网（70μm或40μm）、离心管、移液枪等。

1、组织预处理

1）新鲜组织转移至含预冷PBS的培养皿中，用PBS冲洗2-3次，去除表面血迹和杂物；

2）眼科剪将组织剪碎成1-2 mm³的小块，尽量去除脂肪、结缔组织等非目标成分。

2、酶消化处理

1）据组织块体积，加入适量消化酶混合液（如1 mg/mL胶原酶+0.1 mg/mL DNase I，用无钙镁PBS配制），确保完全覆盖组织块。

2）37℃恒温振荡孵育30-60分钟（时间根据组织硬度调整，如肝脏约30分钟，肿瘤组织可延长至90分钟），期间每隔10分钟轻柔吹打，促进消化。

3、终止消化与细胞过滤

1）加入含5% FBS的RPMI 1640培养基终止消化，用移液枪反复吹打组织悬液，使细胞充分释放。

2）将悬液通过70μm细胞筛网过滤至50 mL离心管中，用PBS冲洗筛网，收集滤液。

4、离心与洗涤

1） 滤液在4℃下300g rpm离心5-8分钟，弃上清，沉淀用5 mL RPMI 1640培养基重悬。

2） 重复离心洗涤1-2次，去除消化酶和细胞碎片。

5、细胞计数与活性检测

1） 取少量细胞悬液与AOPI染液按1:1混合，加入到细胞计数板，在细胞计数仪上检测细胞活性。或取少量细胞悬液与台盼蓝染液按1:1混合，滴入血球计数板，在显微镜下计数活细胞（未染色细胞为活细胞）。

2） 调整细胞浓度至7×10⁵-1.2×10⁶ cells/mL，若浓度过高，用RPMI 1640培养基稀释；若过低，可低速离心后重悬。

1、组织新鲜度：获取组织后尽快处理，避免长时间放置导致细胞死亡。

2、酶的选择：不同组织需优化酶的种类和浓度，如肌肉组织可加透明质酸酶，神经组织需降低酶浓度以防细胞损伤。

3、温度与吹打力度：消化过程严格控制温度，吹打时避免用力过猛，防止细胞机械损伤。

4、酶解时间：避免过度消化（如超过40分钟），否则易导致细胞表面抗原破坏，影响后续测序分析。可通过细胞计数仪实时检测细胞活性，当细胞活性及数量突然开始降低时立即终止消化。

5、温度控制：消化过程需严格维持37℃，温度波动会导致酶活性不稳定，曾实验发现40℃消化会使细胞活性下降40%。

1、细胞成团：可能消化不充分，可延长消化时间或增加酶浓度，过滤前充分吹打。

2、细胞活性低：检查消化温度是否过高、FBS是否及时终止酶活性，或组织离体时间过长。

1、取材时间：动物处死后需在30分钟内完成组织分离，超过30分钟会导致细胞活性显著下降（＞20%）。

2、取样准确：尽量剔除非目标组织，如多余脂肪、包膜；清洗去除血液残留血液清洗：使用 1×DPBS 或生理盐水对取样后的组织样本即时反复清洗，尽可能去除血细胞。

3、取样量：常规组织：样本量≥200mg（至少黄豆大小）

穿刺组织：≥3条（长度1.5cm，直径≥1.5mm）

4、保存条件及运输：取材后立即放入预冷的组织保存液（美天旎：130-100-008）中，用气泡袋包裹放有组织的离心管，并在气泡袋周围放上冰袋，切记不可冰袋直接接触样本，离体48h 内运输至公司实验室开展单细胞悬液制备。

单细悬液制备结果展示：

单细胞悬液解离是一门“经验与技术结合”的艺术，我们凭借数千例项目的实操积累，已建立覆盖多物种、多组织的标准化解离体系，可根据样本特性定制最优方案。想了解更多关于单细胞悬液的制备方法，请继续关注爱基百客微信公众号。如需了解更多细节或获取个性化解离服务，欢迎联系我们。让每一份组织样本都释放最大科研价值，是我们始终坚守的专业追求。

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