项目文章Adv sci（IF:14.1）|ATAC-seq+CUT&Tag表观多组学助力解析头颈部鳞状细胞癌的耐药性机制

2025 年 4 月安徽医科大学第一附属医院查晓军团队在《Advanced Science》（IF=14.1）杂志发表题目为《PRMT1-Mediated SWI/SNF Complex Recruitment viaSMARCC1 Drives IGF2BP2 Transcription to Enhance Carboplatin Resistance in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma》的研究论文，该文利用RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag、ChIP等技术方法探究了PRMT1通过招募SWI/SNF染色质重塑复合体激活IGF2BP2转录，从而增强头颈部鳞状细胞癌(HNSCC）对卡铂(CBP）耐药性的机制。这些发现为克服HNSCC中的CBP耐药性提供了新的治疗靶点和策略。爱基百客为该研究提供ATAC-seq和CUT&Tag的技术支持。

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球第六大常见恶性肿瘤，具有高发病率和死亡率，其治疗方式主要包括手术、化疗、靶向治疗和放疗。铂类化疗药物（如卡铂CBP）是治疗晚期或无法手术的HNSCC的主要手段，但肿瘤细胞常对其产生耐药性，导致治疗失败和复发。蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1）在多种癌症中高表达，并与肿瘤的发生和进展密切相关。尽管已有研究表明PRMT1在其他癌症中促进化疗耐药，但其在HNSCC中的作用机制尚不明确。

为了确定HNSCC中CBP耐药性最关键的PRMT，作者使用siRNA敲低FaDu细胞中的PRMT1-9，并评估它们在不同CBP浓度下的存活率。在PRMT家族中，PRMT1敲低显著增加CBP敏感性（图1A）。利用RNA-seq在CBP处理且PRMT1敲低细胞鉴定到6721个差异表达基因（DEG），其中3404上调和3317下调基因。GO富集分析显示，上调基因主要富集在在细胞凋亡、自噬和组蛋白修饰途径（图1B，C），而下调基因与小GTP酶介导的信号转导、高尔基体囊泡转运、氨基酸代谢等相关。作者检测了PRMT1在HNSCC中的表达、TCGA数据集和单细胞RNA-seq数据（GSE181919）的分析揭示了与邻近正常粘膜（ANM）相比，HNSCC组织中的PRMT1显著上调（图1D，E）。对12对HNSCC和ANM样本进行免疫组化染色（IHC）、WB和qRT-PCR分析证实了这一趋势（图1F、G）。类似地，PRMT1的mRNA和蛋白水平在HNSCC细胞系中升高，对应蛋白定位在核内。

为了选择合适的细胞系进行功能研究，作者评估了多种HNSCC细胞系的CBP50%抑制浓度（IC50）值，发现CBP耐药性与PRMT1表达之间呈正相关。选择LIU-LSC-1细胞（高PRMT1，CBP抗性）用于PRMT1敲减，选择TU177细胞（低PRMT1，CBP敏感性）用于过表达。通WB和qRT-PCR验证了对PRMT1的成功处理（图1H）。细胞毒性试验、集落形成试验和膜联蛋白-V/PI染色（图1I）证实PRMT1沉默增强CBP敏感性，而过表达增加耐药性。此外，在敲低细胞中恢复PRMT1，成功挽救了CBP抗性。使用保留肿瘤异质性和组织学特征的PDO模型，作者进一步评估了PRMT1沉默对CBP反应的影响。组织学分析证实，HNSCC类器官保留了原始肿瘤特征（图1K）。同样，PRMT1耗竭显著增强CBP对类器官生长的抑制作用（图1L-N）。总之，PRMT1在HNSCC中高度表达，并通过抑制细胞凋亡在CBP耐药中起关键作用，使其成为潜在的治疗靶点。

图1 PRMT1在HNSCC中的过表达增强了对CBP的抗性。

作者建立了细胞系来源异种移植（CDX）模型，通过将 shPRMT1#1 LIU-LSC-1 细胞和对照细胞皮下接种到裸鼠中构建荷瘤鼠模型。荷瘤鼠接受腹腔内注射CBP或生理盐水两周后，结果显示PRMT1敲低显著抑制肿瘤生长并增强CBP的抗肿瘤作用。

考虑到患者来源异种移植模型（PDX）比CDX模型更好地模拟人类肿瘤，作者进一步评估了PRMT1抑制与PDX模型中CBP的组合。选择具有高PRMT1表达的新鲜HNSCC肿瘤用于模型建立（图2A-C）。小鼠接受肿瘤内PRMT1siRNA或对照siRNA（siNC），沿着腹膜内CBP/盐水三周。与CDX发现一致，PRMT1敲低显著抑制肿瘤生长，并且PRMT1干扰组中的肿瘤显示出升高的CBP敏感性（图2D-F）。通过IHC，Ki67和裂解的半胱天冬酶-3染色模式反映了CDX模型中PRMT1敲低成功（图2G-H）。为了研究PRMT1在自发性HNSCC中的作用，作者构建了Prmt1^cKO小鼠模型。在该模型中，通过将Prmt1^fl/fl小鼠与Krt14^Cre/ERT2小鼠杂交，随后进行他莫昔芬诱导的基因缺失，在口腔上皮中特异性缺失PRMT1（图2I）。小鼠用4NQO处理16周以诱导HNSCC，然后从第24周开始给予他莫昔芬，随后给予CBP。Prmt1^cKO小鼠的病变比Prmt1^Ctrl小鼠更少且更小，CBP给药后目视检查未检出病变（图2J）。组织学分级显示Prmt1^cKO小鼠的严重程度降低，CBP进一步降低（图2K）。此外，裂解的半胱天冬酶-3升高，表明细胞凋亡增强，尤其是CBP处理（图2L）。总之，PRMT1沉默增加了HNSCC中CBP的敏感性，突出了PRMT1有望作为治疗靶点。

图2 .PRMT1的耗竭增强CBP在体内的有效性

为了鉴定PRMT1的下游靶标，作者对PRMT1敲低和对照LIULSC-1细胞进行了RNA-seq和ATAC-seq。RNA-seq鉴定了2598个DEG，包括1077个下调基因和1521个上调基因（图3A）。ATAC-seq结果显示染色质可及性发生显著变化，9930个差异峰分布在启动子（28.58%）、内含子（25.34%）、外显子（23.35%）、非翻译区（14.59%）和基因间区（8.14%）（图3B）。整合PRMT1敲低细胞中的下调基因和差异峰相关基因与TCGA-HNSCC数据集中上调基因，鉴定了11个重叠候选基因（图3C）。CBP治疗的TCGA-HNSCC患者（n=45）数据分析显示，MAD1L1、CDH2、PABPC1L和IGF2BP2的高表达与不良预后相关（图3E）。

鉴于缺乏公开的HNSCCCBP抗性数据集，作者使用OncoPredictR包对TCGA-HNSCC患者进行分类，与CBP敏感组（底部25%）相比，CBP抗性组（顶部25%）中IGF2BP2、CDH2和MAD1L1显著上调（图3D）。值得注意的是，仅IGF2BP2敲低显著增强了LIU-LSC-1细胞中的CBP敏感性。对12对HNSCC和ANM组织的进一步分析证实了肿瘤中IGF2BP2的mRNA和蛋白质水平均有所升高（图3F-G），将IGF2BP2鉴定为关键的PRMT1效应子。

为了探索PRMT1-IGF2BP2的调控关系，作者检测了PRMT1敲低或过表达状态下的IGF2BP2表达水平。PRMT1敲减降低了IGF2BP2水平，而其过表达增加了IGF2BP2水平（图3H）。Prmt1-缺陷小鼠病变IGF2BP2表达也出现显著降低（图3I）。ATAC-seq显示PRMT1敲减降低了IGF2BP2启动子处的染色质可及性（图3J），表明IGF2BP2是HNSCC中PRMT1的直接下游靶点。IGF2BP2沉默增强了CBP诱导的细胞存活和集落形成抑制，同时增强了LIU-LSC-1细胞的凋亡（图3K）。体内异种IGF2BP2敲低显著抑制了肿瘤生长，CBP进一步增强了该作用（图3L-N）。IHC分析显示IGF2BP2沉默降低了Ki67表达并增加了裂解的半胱天冬酶-3的表达，表明增殖减少和凋亡增加，这两种情况均被CBP处理放大（图3O）。总之IGF2BP2也是HNSCC中CBP耐药的关键驱动因子。

图3 IGF2BP2是PRMT1的关键下游靶标

为了研究IGF2BP2在PRMT1功能中的作用，作者在PRMT1敲低的LIU-LSC-1细胞中过表达IGF2BP2（图4A）。进行了细胞毒性测定，包括IC50测量和集落形成测定，显示IGF2BP2挽救受损的增殖并抵消由PRMT1消耗引起的CBP敏感性增加（图4B，C）。细胞凋亡测定进一步揭示，PRMT1敲低，特别是CBP处理，显著增加HNSCC细胞中的细胞凋亡，这被IGF2BP2过表达部分逆转（图4D）。作者将这些发现扩展到头颈部鳞状细胞癌患者来源类器官（HNSCCPDOs），其中PRMT1敲低抑制生长并增强CBP敏感性-IGF2BP2过表达抵消了这种作用（图4E）。相反，在PRMT1过表达的TU177细胞中IGF2BP2敲低（图4F）减弱了PRMT1的保护作用，减少了CBP处理下的癌细胞存活和增殖（图4G，H）。PRMT1过表达也抑制CBP诱导的细胞凋亡，IGF2BP2敲低则恢复CBP敏感性（图4I）。类似地，在HNSCCPDOs中，IGF2BP2敲低逆转了PRMT1诱导的CBP耐药性（图4J）。在体内，通过将IGF2BP2过表达的shPRMT1#1LIU-LSC-1细胞/对照细胞注射到裸鼠中来建立CDX肿瘤模型。小鼠接受腹膜内CBP/盐水两周。IGF2BP2过表达促进肿瘤生长并降低CBP敏感性，而不影响体重（图4K-M）。IHC证实，IGF2BP2过表达逆转了PRMT1敲减肿瘤中CBP诱导的Ki67减少和裂解的半胱天冬酶-3升高（图4N）。总之，PRMT1调节IGF2BP2表达，提高了HNSCC中的CBP抗性。

图4 PRMT1通过上调IGF2BP2增强HNSCC细胞对CBP的抗性

为了评估PRMT1使IGF2BP2上调是否独立于其酶活性，作者在TU177细胞中过表达三种催化失活的PRMT1突变体（G80R，M48A，M155A）。与野生型（WT）PRMT1一样，这些突变体增加IGF2BP2表达。此外，用PRMT1特异性抑制剂iPRMT1处理有效地降低了H4R3me2a水平，这是一种PRMT1催化的组蛋白标记，但对LIU-LSC-1细胞中IGF2BP2表达的影响极小。这些发现表明PRMT1调节IGF2BP2独立于其催化功能。

为了探索潜在的机制，作者进行了IP-MS以鉴定PRMT1相互作用蛋白（图5A）。其中，较为突出的是鉴定到SMARCA4和其他SWI/SNF复合物亚基（SMARCC1、BRD7、SMARD3、SMARCE1）（图5B）。Co-IP进一步验证其相互作用（图5C）。此外，siRNA敲除实验揭示，仅SMARCC1耗尽会破坏PRMT1与SWI/SNF复合物的结合，从而鉴定SMARCC1为其关键结合（图5D）。LIU-LSC-1和HEK293T细胞中的Co-IP进一步验证了PRMT1和SMARCC1相互作用（图5E，F）。IF测定显示它们在LIU-LSC-1和TU177细胞中的核共定位（图5G），表明PRMT1通过SMARCC1募集SWI/SNF复合物。

图5 .PRMT1通过与SMARCC1互作募集SWI/SNF染色质重塑复合物后激活IGF2BP2转录

为了研究HNSCC进展过程中PRMT1表达升高的机制，作者使用4个公开数据库生信分析确定了29个潜在转录因子TFs（图6A）。为了缩小候选TF的范围，作者在TCGA-HNSCC数据集中进行相关性分析，对应PRMT1表达与6种TF呈正相关：NFYB、MAZ、TEAD4、PBX2、JUND和NFYA（图6A）。随后siRNA介导的敲除这6个TF显示，仅PBX2耗竭显著降低了PRMT1的mRNA和蛋白水平。TCGA-HNSCC数据集的分析显示，与ANM组织相比，HNSCC组织中PBX2的显著上调（图6B）。此外，对12对HNSCC和ANM样品的分析证实了HNSCC组织中PRMT1表达的显著升高（图6C）。PBX2shRNA敲减导致PRMT1和IGF2BP2表达显著降低（图6D）。相反，PBX2过表达在mRNA和蛋白质水平均增加了PRMT1和IGF2BP2水平（图6E）。PDO实验表明，PBX2耗竭显著降低了PDO中PRMT1和IGF2BP2的表达（图6F）。

为了进一步研究PBX2调节PRMT1的机制，使用HA特异性抗体在HAPBX2过表达的TU177细胞中进行了CUT&Tag（图6G）。CUT&Tag结果显示，相对于IgG组，HA-PBX2组中PRMT1基因内的peak显著增加（图6H）。对PRMT1基因的CUT&Tag测序结果中增加的peak区域（19q13.2：49676396-49677556）使用JASPAR预测了PBX2结合位点（-384/373;GTGATGGACAGG）（图6I）。ChIP-qPCR证实了PBX2在该位点的富集（图6J）。接下来，将PRMT1基因的启动子区（-426/+153）克隆到pGL3-basic荧光素酶报告载体中，进行双荧光素酶报告基因检测；PBX2过表达显著增加了WT构建体的荧光素酶活性，而结合位点的突变消除了这种作用（图6K）。ChIP-qPCR分析进一步验证了HA-PBX2过表达细胞中PRMT1启动子区的PBX2占据（图6L）。此外，ChIP-qPCR显示，敲低PBX2或PRMT1对应降低了SMARCC1在IGF2BP2启动子上的占有率（图6M），而PBX2或PRMT1过表达增强了SMARCC1的占有率（图6N）。这些发现表明，PBX2直接结合PRMT1基因，促进其转录，并通过募集SWI/SNF复合物上调IGF2BP2表达。

图6 PBX2在HNSCC细胞中激活PRMT1基因表达

采用IHC分析85例临床HNSCC病例中PBX2、PRMT1、SMARCC1和IGF2BP2的表达水平。使用Hscores定量蛋白质表达水平，揭示了与ANM组织相比，HNSCC组织中PBX2、PRMT1、SMARCC1和IGF2BP2的水平显著增高（图7A、B）。这些蛋白质的IHC分析显示，与早期阶段（T1/T2）相比，晚期T阶段（T3/T4）的H评分显著更高，表明表达升高与肿瘤进展相关（图7C）。此外，根据PBX2、PRMT1、SMARCC1和IGF2BP2的中位表达水平，将85例HNSCC病例分为高表达组和低表达组。如图7D-G所示，这些蛋白质的水平升高与HNSCC患者的预后较差相关。相关性分析进一步揭示了85例中它们的表达水平之间的正相关性（图7H）。该观察结果与TCGA-HNSCC数据集和GSE130605的结果一致（图7I）。

接下来，基于85个HNSCC样品中的PBX2、PRMT1、SMARCC1和IGF2BP2的表达水平生成受试者操作特征（ROC）曲线，分别产生0.853、0.896、0.864和0.893的曲线下面积（AUC）值（图7J）。ROC曲线分析也对应得到相似结果（图7K）。这些一致的发现表明，PBX2、PRMT1、SMARCC1和IGF2BP2在肿瘤组织中的表达由于其高灵敏度和特异性而可作为HNSCC的可靠诊断标志物。总之，活化的PBX2-PRMT1-SWI/SNF-IGF2BP2信号传导途径可能在HNSCC的进展和预后中起着关键作用（图7L）。

图7 PBX2-PRMT1-SWI/SNF-IGF2BP2信号级联激活与HNSCC恶性进展和预后不良相关

这篇文章揭示了PRMT1通过非甲基转移酶依赖的方式促进头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)对卡铂(CBP）的耐药性。研究发现，PRMT1通过直接与SWI/SNF染色质重塑复合物的SMARCC1亚基相互作用，招募该复合物并激活胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2(IGF2BP2)的转录，从而增强CBP耐药性和肿瘤生长。这一机制独立于PRMT1的酶活性。此外，转录因子PBX2被鉴定为PRMT1的上游激活因子，通过结合PRMT1启动子促进其过表达，进一步强化了这一致癌网络。临床数据显示，PBX2、PRMT1、SMARCC1和IGF2BP2的高表达与HNSCC患者的恶性进展和不良预后密切相关。研究确立了PBX2-PRMT1-SWI/SNF-IGF2BP2轴作为克服CBP耐药性的潜在治疗靶点。

此文中CUT&Tag精准定位转录因子PBX2在PRMT1启动子上的结合位点，证实其转录激活作用；ChIP-qPCR验证了PRMT1与SMARCC1在IGF2BP2启动子的协同结合，阐明其通过SWI/SNF复合物调控转录的机制；ATAC-seq则揭示了PRMT1敲低导致IGF2BP2启动子染色质可及性显著降低，从表观遗传层面证实了该调控轴的功能。这三种技术相互印证，完整解析了从转录调控到染色质重塑的分子通路。

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