快速get国自然热点—单细胞免疫组库的研究思路

• T细胞：来源于骨髓的淋巴样干细胞，在胸腺中分化、发育成熟。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。主要的功能：有识别并直接杀伤被感染的细胞、肿瘤细胞等靶细胞；辅助和抑制B细胞产生抗体；能够合成和释放多种细胞因子，促进或抑制免疫反应的进行。

• B细胞：由哺乳动物骨髓或鸟类法氏囊中淋巴样干细胞发育而来。在骨髓中，造血干细胞经过一系列分化和成熟过程，最终具备识别和结合抗原的能力。主要的功能：受抗原刺激后，会分化为浆细胞，促进病原体的清除；免疫记忆，B细胞具有记忆性，即一旦遭遇同一种病原体再次入侵时，记忆B细胞能够迅速产生抗体，加强免疫应答，快速消除病原体；B细胞可以通过产生细胞因子参与调节巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞等免疫细胞的功能，影响免疫反应的强度和方向。

• 免疫组库（Immune Repertoire, IR）：在某一时间，生物个体的免疫系统中所有功能多样性T细胞和B细胞的总和。

• 免疫组库的多样性：个体免疫系统中T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）的基因序列多样性。这种多样性主要通过V(D)J基因重排、连接区域的随机插入/删除以及B细胞的体细胞高频突变产生，使免疫系统能够识别和应对各种病原体。

• TCR：两个不同的多肽链组成，通常是一个α链和一个β链，但在某些T细胞中，可能由γ链和δ链组成。每个链由一个可变区（V区）和一个恒定区（C区）组成，V区负责抗原识别。

• BCR：实际上是B细胞表面的膜结合免疫球蛋白（mIg），可以是IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。BCR由两个相同的重链和一个轻链组成，形成Y形结构。

图1. TCR/BCR结构（图来自10X）

• 可变区域：TCR/BCR都含有三个互补决定区（CDR1、CDR2和CDR3），其中CDR1和CDR2由V区编码，结构相对保守，负责识别MHC（主要组织相容性复合体）；CDR3位于V(D)J重组的连接处，是最具多样性的区域，决定了抗原识别的特异性。这三个CDR区共同形成抗原结合位点，参与抗原识别和结合。

图2. TCR/BCR结构域

二、免疫组库研究方法比较

传统的免疫组库研究技术主要依赖多重PCR或RACE扩增TCR/BCR的CDR3区域，再结合高通量测序进行分析。然而，这种方法通常只能获取单条链（α/β或γ/δ，轻/重链）的信息，无法进行受体的双链配对研究，从而难以确定在抗原刺激下具体哪些免疫细胞及其受体在执行功能。因此，提升免疫组库研究的分辨率对于深入理解机体免疫机制至关重要。

这一瓶颈在2015年随着10x Genomics Chromium单细胞平台的推出取得了突破。该平台基于微流控油滴包裹技术，可同时进行高通量的单细胞转录组测序和单细胞V(D)J测序。其核心优势在于：不仅能精准匹配TCR/BCR的双链（例如，TCRα与TCRβ链，BCR重链与轻链），获取完整的双链组成信息，更能细化到单细胞层面，将这些免疫受体序列与该细胞的5'端转录组表达信息直接关联。

三、scVDJ-seq技术简介

scVDJ-seq利用微流控、油滴包裹和barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，在单细胞水平同时检测转录组基因表达和TCR/BCR多样性，不但可以了解TCR/BCR克隆型，还可以联合转录组数据深入挖掘生命机理，为免疫组学研究提供更高效的平台。

B细胞或者T细胞里，V(D)J 区段是在mRNA 的5'端，所以和Gel Bead表面携带的Barcode和UMI所在的核酸序列紧挨着的是mRNA的5‘端，以便捕获全长的V(D)J序列。

在每一个单独的GEM里，除了Gel Bead表面携带的Barcode和UMI所在的核酸序列，还有游离的poly-dT作为引物来结合RNA 3'端 poly(A)尾巴来扩增得到全长cDNA，这一步是发生在每个GEM内部。

GEM裂解后，所有细胞cDNA混在一起进行扩增以达到建库要求，扩增后的产物分成2份同时进行TCR/BCR的V(D)J文库构建和5’单细胞转录组文库构建，获得每个细胞表达谱和V(D)J全长序列。来自同一细胞的VDJ文库序列和转录组文库序列有相同的细胞标签(Barcode)，这样每个细胞转录组数据可以对应该细胞的V(D)J信息。

10x VDJ-seq实验流程图

• 药物治疗的免疫响应：药物治疗或免疫检查点（如PD-L1）治疗是目前对于癌症目前比较热门的医疗领域治疗方法，但并不是所有癌症或疾病都能够对其有良好的治疗响应。研究药物或免疫检查点治疗后免疫微环境的变化有利于揭示肿瘤的免疫逃逸机制。

• 骨髓移植和免疫重建：器官或者骨髓移植时，经常会诱发宿主排斥反应的发生，从而发生慢性移植抗宿主病。此外，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法由于显著的抗肿瘤作用，彻底改变了血液疾病恶性肿瘤的临床治疗。免疫组库测序技术可以检测移植后T细胞库，进行从而识别移植后感染或者复发的高危人群以及CAR-T治疗响应。

• 新靶点的开发：药物靶点是指药物在人体内的作用结合位点，不同的疾病/组织类型对相同的药物响应是不一样的，多位点药物靶点的寻找有利于后续临床开发靶向这些靶点的免疫治疗药物，从而能够使得更多患者对治疗产生正向反应。

从实验组和对照组中分离B/T细胞，进行scRNA-seq和scVDJ-seq，利用生物信息学工具进行分析，以识别B/T细胞亚群和它们的转录特征。随后基于基因表达模式，使用聚类算法将B/T细胞分为不同的亚群，比较实验组和对照组之间的基因表达差异。接下来，通过BCR/TCR使用特征分析、克隆型分析对B/T细胞异质性进行研究。

• 先进平台保障捕获效率：严格选用10x Genomics、华大、寻因等提供高捕获效率的专业单细胞平台。

• 样本处理经验丰富：拥有处理多样化样本类型的成熟技术，尤其在复杂样本的单细胞悬液制备方面经验深厚。

• 专业生信支持解读精准：配备高水平生物信息学团队，提供从数据处理、深度挖掘到专业解读的全方位分析服务。

• 高效交付与成本优势：致力于优化服务流程，提供更具性价比的综合报价以及高效、稳定、快速的结果交付。

项目咨询

精选合集，欢迎收藏哟！

• 项目文章集锦

• ChIP专题

• DAP-seq专题

• ATAC-seq专题

• 单细胞测序专题

• CUT&Tag专题

• 甲基化专题

• RIP-seq专题

• 云平台教程

• 国自然热点