Nature文献分享 | ChIP-seq助力揭示哺乳动物异染色质形成与维持机制

真核生物基因组的分区化，特别是常染色质和异染色质的分区化对生物学具有重要意义。之前的研究表明，SUV39H在细胞分裂过程中通过读取和写入组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）来重新组装异染色质。

2025年10月15日，华东师范大学翁杰敏团队与中国科学院陈德桂团队在期刊Nature在线发表了题为“A conserved H3K14ub-driven H3K9me3 forchromatin compartmentalization”的联合研究，首次提出“H3K14ub→H3K9me3”是哺乳动物染色质区室化（chromatin compartmentalization）的保守驱动轴心。

研究者首先利用自制的特异性抗H3K14ub抗体，对含2227个人类核蛋白的表达文库进行384孔板高通量过表达筛选（fig.1a），发现G2E3和PHF7能显著增强细胞H3K14ub免疫荧光信号；鉴于PHF7睾丸特异性表达，后续聚焦G2E3。接着在HeLa与293T细胞中外源表达Myc-G2E3，WB和免疫荧光均显示H3K14ub水平显著升高（fig.1b-c）。体外泛素化体系进一步证实，纯化的G2E3在E1、UbcH5c和泛素存在下可直接催化小牛胸腺核心组蛋白H3的单泛素化，且H3K14R突变完全丧失泛素化（fig.1d-e），确立其位点特异性。结构-功能分析表明，三个N端PHD结构域缺一不可，而C端HECT域缺失或点突变（C84A等）不影响活性（fig.1f）。生理水平上，两种shRNA敲低或CRISPR敲除G2E3几乎完全消除HeLa、MCF7和HCT116细胞中的H3K14ub信号（fig.1g-i），证明G2E3贡献了细胞内绝大部分H3K14ub。免疫荧光共定位实验显示，外源Myc-G2E3与内源H3K9me3、SUV39H2均富集于DAPI致密的着丝粒周围异染色质区（fig.1k），而G2E3缺失使这些区域的H3K14ub焦点完全消失（fig.1i-l）。综上，该研究确立了G2E3是哺乳动物催化大量H3K14单泛素化的关键E3连接酶，且该修饰优先出现在着丝粒周围异染色质。

Fig.1 G2E3是一种与着丝粒周围异染色质相关的特异性催化H3K14泛素化的E3泛素连接酶

进一步通过IF和WB实验发现，G2E3通过其E3泛素连接酶活性催化H3K14位点的单泛素化（H3K14ub），且该修饰特异性地促进SUV39H1/2介导的H3K9me3修饰（fig.1b–e、fig.2a–c）。在HeLa、MCF7和HCT116细胞中敲低或敲除G2E3显著降低H3K14ub和H3K9me3水平，尤其在着丝粒周围异染色质区域，同时削弱SUV39H2和HP1蛋白的定位（fig.1g–i、fig.2e–f）。相反，外源表达野生型G2E3可恢复H3K14ub和H3K9me3水平，而其酶活性缺失突变体G2E3m3则无此功能（fig.2b–d）。进一步实验表明，G2E3促进H3K9me3依赖于SUV39H1/2，尤其在SUV39H2敲除或SUV39H1/2双敲除细胞中，G2E3无法提升H3K9me3水平（fig.2g–i）。综上，G2E3通过催化H3K14ub修饰，招募并激活SUV39H1/2，从而促进着丝粒周围异染色质区域H3K9me3的建立与维持。

Fig.2 G2E3通过其H3K14泛素连接酶活性，特异性促进SUV39H催化的H3K9me3修饰

通过WB检测同步化细胞（fig.3a）和3×HA敲入等位基因IF（fig.3f）发现G2E3在G2/M期高表达并全程结合有丝分裂染色体；同期H3K14ub峰值依赖G2E3（fig.3a,b）。中期SUV39H2/HP1脱离后，后期SUV39H2先回贴染色体（fig.3g），末期HP1再聚集，而G2E3-KO严重阻断这一重定位（fig.3g）。RNase A擦除G2E3信号且RIP显示其优先结合α-卫星RNA，证明G2E3借助RNA锚定染色体，在M期通过H3K14ub招募SUV39H，进而完成着丝粒周围异染色质H3K9me3-HP1级联重建。

Fig.3 G2E3在G2/M期强烈催化H3K14ub，从而将SUV39H靶向至着丝粒周围异染色质

虽未能检出SUV39H2与G2E3的蛋白互作，体外pull-down显示GST-SUV39H1/2可特异性富集来自Myc-G2E3过表达细胞的K14-泛素化H3（fig.4a）。共定位实验表明，仅含N端染色质结构域的SUV39H2片段即可与Myc-G2E3共斑（fig.4b），缺失该结构域则完全丧失共定位及与固定化H3K14ub肽的结合能力（fig.4c）。分子对接提示染色质结构域可同时容纳H3K9me3与H3K14ub（fig.4d）。将预测关键氨基酸D54、W78等突变为丙氨酸后，D54A和W78A完全失去与G2E3共斑及结合K14-泛素化H3的能力，而仅影响H3K9me3结合的W68A突变体共斑仅轻微下降（fig.4e-g）。进一步构建已知破坏H3K9me3结合的复合突变体（F54A/V56A、W68A/W71A等），这些突变仍部分共斑于G2E3。体外泛素化pull-down定量显示，GST-SUV39H2(1-105aa)对经G2E3催化生成的H3K14ub肽亲和力比非修饰H3提高约17倍，对H3K9me3/K14ub双修饰肽最高（约28倍）（fig.4h）。功能上，D54A、W68A、W78A突变体在SUV39H2-KO细胞中重建H3K9me3的能力均显著减弱（fig.4i）。综上，SUV39H染色质结构域以H3K14ub结合为主、H3K9me3为辅，两者协同将SUV39H1/2靶向至着丝粒周围异染色质，并增强其甲基转移酶活性。

Fig.4 SUV39H的染色质结构域是一种能够同时识别H3K14ub和H3K9me3的双功能“阅读器”

为在全基因组水平厘清G2E3催化H3K14ub与H3K9me3的关系，作者在母本HeLa及G2E3 KO-10细胞中做了ChIP-seq，MACS2峰calling在野生型中鉴定到6,286个H3K14ub峰，其中5,564个与H3K9me3重叠，却几乎不与H3K4me3共存（fig.5a）。G2E3缺失使H3K14ub峰数目和强度骤降，同时导致重叠区内H3K9me3信号显著衰减（fig.5a,b）。这些共定位峰高度集中于着丝粒周围卫星序列（pericentromeric satellites）和中心粒α-卫星重复（α-satellite），且远离启动子；代表性染色体1、5、7轨迹显示G2E3 KO后这两类区域H3K14ub与H3K9me3同步大幅丢失（fig.5b,c）。相反，在Alu、LINE1、ERVK等转座子处H3K14ub本底极低，敲除G2E3未降低反而轻微升高H3K9me3（fig.5d）。ChIP-qPCR验证：spc、alphoid、alpha-R1-7等重复元件富集H3K9me3，且G2E3缺失后显著下降（fig.5e）；同时SUV39H2在这些序列上的结合减少，而在LINE1、Alu、EAR等处结合增加（fig.5f,g）。RNA-seq显示G2E3丢失导致全基因组水平着丝粒周围卫星序列转录上调（fig.5h），RT-qPCR重复证实α-卫星RNA升高（fig.5i）；同样现象见于HeLa/MCF7中G2E3敲低。由于SUV39H2-KO本身即可引起α-卫星转录增加（fig.5j），提示G2E3通过SUV39H依赖机制抑制这些重复序列的异常转录。综上，G2E3催化H3K14ub主要标记并维持着丝粒/着丝粒周围异染色质上的H3K9me3与SUV39H2结合，从而沉默着丝粒周围异染色质。

Fig.5 H3K14ub在着丝粒周围异染色质中高度富集，并且对于该区域的H3K9me3是必需的

ChIP-seq对比对照与G2E3 KO-10 HeLa显示：尽管着丝粒周围H3K9me3强度下降（fig.5b），峰总数却由17114激增至43711。分层分析定义三组峰——①13217个“新峰”无H3K14ub、落在常染色质，强度最弱；②4,422个“丢失峰”高H3K14ub、对应α-卫星，强度最高，在KO中锐减；③其余峰变化小（fig.6a,b）。区域注释证实KO后着丝粒周围H3K9me3下调而常染色质广泛上调（fig.6c）。RNA-seq发现6456个基因下调，其中45%启动子/基因体或其±20kb内获得新H3K9me3峰；代表性轨迹显示这些区域H3K14ub极低但H3K9me3升高且转录受抑（fig.6e）。ChIP-qPCR验证6个随机新峰H3K9me与SUV39H2结合均上升（fig.6f,g），qRT-PCR证实对应基因沉默（fig.6h）。综上，G2E3通过将SUV39H/H3K9me3限制在着丝粒周围异染色质，防止其扩散至常染色质，从而维持真核基因组正确分区和基因表达。

Fig.6 G2E3对于维持适当的常染色质区室化和转录调控是必需的

本文围绕哺乳动物异染色质组装机制展开，揭示了E3泛素连接酶G2E3通过催化组蛋白H3第14位赖氨酸的单泛素化（H3K14ub），在细胞分裂过程中驱动SUV39H甲基转移酶定位于中心粒周围异染色质，进而促进H3K9me3修饰和HP1蛋白招募，从而维持异染色质结构和功能，并防止SUV39H错误定位于常染色质，确保染色质正确分隔和基因表达调控。

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