ATAC-seq实验全流程详解与关键质控指南

染色质可及性（Chromatin Accessibility）是表观遗传学研究的核心，它如同基因调控的“开关地图”，直接决定了哪些基因能够被表达。ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）技术，凭借其所需细胞量少、实验流程简单、分辨率高等优势，已成为绘制这张“地图”的金标准。

然而，一个高质量的ATAC-seq数据，其背后离不开对每个实验环节的精准把控。本文将带您深入ATAC-seq实验的四大核心阶段——细胞核提取与质控、转座酶酶切反应、产物纯化与片选择、文库扩增与质控，详解步骤、揭秘质控要点，助您轻松获得可信赖的高质量数据。

• 样本准备： 收集新鲜或冻存的样本进行细胞或细胞核提取和质检（通常10⁵个细胞，新鲜细胞活率>85%，细胞核完整）。

• 细胞膜裂解： 使用含有去垢剂（如NP-40或Digitonin）的预冷细胞核提取缓冲液重悬细胞，冰上孵育。裂解液浓度和裂解的时间至关重要，需优化以刚好裂解细胞膜而保持核膜完整。

• 终止与清洗： 加入含有BSA的缓冲液终止裂解，然后用预冷缓冲液离心清洗细胞核1-2次，彻底去除细胞质残留。

• 计数与重悬： 用合适的缓冲液重悬细胞核，并使用细胞计数仪进行计数及台盼蓝染色显微镜观察细胞核完整性，最终调整至合适的细胞核量。

• 质控方法：台盼蓝染色显微镜观察细胞核状态，自动细胞计数仪准确计算投入细胞核量

• 关键参数：

• Tips： 对于个别组织样本，需先进行机械研磨或酶消化制备单细胞悬液，再进行核提取；对于一些难以裂解的细胞，可尝试优化去垢剂种类和浓度。

• 质控方法： 此步骤本身难以中途质检，其成功与否高度依赖于上一步细胞核的质量和本步骤的操作精准度。

• 关键参数：

• Tips： 不同细胞核量投入的转座酶量需进行梯度探究，不同来源的转座酶效果也会有差别，孵育条件也需要根据物种类型进行优化。

酶切反应后，对于DNA片段需进行纯化，通常通过磁珠纯化的方式来富集目标长度的片段（主要去除过短的片段和酶本身），以最大化测序数据利用率。

• 质控方法：  Agilent 2100 Bioanalyzer 或其他高灵敏度DNA芯片。

• 关键参数：

• Tips： 此QC步骤至关重要，良好的片段分布是ATAC-seq实验成功的金标准。

纯化后的DNA片段两端已带有部分测序接头，通过P5/P7接头扩增，富集足够上机测序的文库量。

• 质控方法： Agilent 2100 Bioanalyzer 或其他高灵敏度DNA芯片；Qubit 进行精确定量。

• 关键参数：

• Tips： 引物二聚体峰过高，说明PCR前的纯化步骤不佳或PCR循环数过多，会严重降低测序数据质量；核小体分布趋势不是很明显可能影响后续的分析结果。

ATAC-seq实验虽然看似简单但却是一条环环相扣的精巧链条，任何一个环节的疏忽都可能导致最终数据的偏差。只有做到“核质为王、精准操作、质控先行、因事制宜”才能获得高质量、低噪音、信息丰富的ATAC-seq数据，为深入挖掘基因调控的奥秘奠定坚实可靠的基础。

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