项目文章 | Nat Commun & CUT&Tag+RNA-seq助力解析组蛋白乳酸化介导的增生性疤痕形成机制

增生性疤痕（hypertrophic scar, HS）是一种以成纤维细胞过度活化和细胞外基质异常沉积为特征的纤维增生性疾病。代谢重组（向有氧糖酵解转变）和组蛋白乳酸化修饰在多种纤维化疾病中被发现，但其在增生性疤痕中的具体作用和机制不明。

近期，空军军医大学西京医院胡大海教授与官浩副教授团队在国际知名期刊Nature Communications上发表了题为“Lactate derived from macrophages drives skin dermal fibroblasts phenotypic remodeling via MCT1-primed histone H3 lysine 23 lactylation in hypertrophic scar”的研究论文。该研究揭示了增生性疤痕中，处于高硬度微环境的巨噬细胞通过糖酵解产生大量乳酸，后者经转运蛋白MCT1进入成纤维细胞，驱动组蛋白H3K23位点发生乳酸化（H3K23la）修饰，进而激活促纤维化基因HEY2和COL11A1的表达，最终形成自我强化的正反馈环路，导致病理性纤维化。爱基百客为该研究提供CUT&Tag、RNA-seq和ChIP-qPCR的技术支持。

研究结果

代谢组学和分子检测结果一致表明，增生性瘢痕组织存在显著的代谢重编程，表现为糖酵解增强、乳酸积累和氧化磷酸化减弱。HS组织中柠檬酸下降而磷酸烯醇式丙酮酸、乳酸、丙酮酸和ATP升高，提示其能量代谢由线粒体氧化代谢转向有氧糖酵解。与此同时，糖酵解相关基因和乳酸转运蛋白，尤其是MCT1，在HS组织中显著上调，而OXPHOS相关分子如PDHA1、IDH1和IDH2则明显下调，进一步支持这一代谢转换。

值得注意的是，免疫荧光实验表明MCT1主要定位于HS中的α-SMA阳性肌成纤维细胞，并在HS来源成纤维细胞中显著高表达，提示MCT1可能是连接乳酸积累与成纤维细胞活化的重要分子。总体而言，这些结果提示HS微环境中异常积累的乳酸可能通过MCT1介导进入成纤维细胞，进而促进其表型重塑并推动纤维化进展。

图1：增生性瘢痕中糖酵解与乳酸转运能力的增强。

为追踪HS组织中乳酸积累的细胞来源，研究构建了模拟正常与纤维化力学环境的PDMS水凝胶培养体系（模拟增生性瘢痕特有的高机械刚度特征），并结合TGF-β刺激系统比较了多种皮肤细胞的产乳酸能力。结果发现，无论在高硬度基质还是TGF-β刺激条件下，巨噬细胞均表现出最显著的乳酸升高和糖酵解增强，而内皮细胞和成纤维细胞仅表现出有限变化。ATP来源分析进一步表明，巨噬细胞在纤维化相关刺激下发生了由氧化磷酸化向糖酵解主导的代谢转换。

原代细胞分选和体内验证实验进一步证实，HS来源巨噬细胞具有显著更高的乳酸生成能力和糖酵解活性；同时，糖酵解关键酶HK2和LDHA主要在HS组织的巨噬细胞中上调，而在其他免疫细胞或内皮细胞中并不显著。更重要的是，清除小鼠瘢痕组织中的巨噬细胞可明显降低局部乳酸水平。综合表明，巨噬细胞是HS纤维化微环境中乳酸的主要来源，机械硬度增加和TGF-β信号增强可独立驱动其发生糖酵解代谢重编程。

图2：巨噬细胞是瘢痕代谢微环境中乳酸积聚的主要来源。

基于前期研究发现HS微环境中肌成纤维细胞MCT1表达升高且巨噬细胞存在乳酸积累，研究进一步探讨了MCT1及巨噬细胞来源乳酸在成纤维细胞表型重塑中的作用。研究分别收集了不同基质刚度的条件培养基，并将其作用于正常皮肤成纤维细胞（NSFs）。结果显示来自50 kPa高刚度基质培养巨噬细胞的条件培养基可显著诱导NSFs纤维化标志物表达升高，而MCT1特异性抑制剂AZD3965可明显减弱这一效应。进一步分析发现，AZD3965不仅降低了Mφ-CM@50kPa诱导的纤维化标志物表达，还逆转了成纤维细胞迁移能力、增殖能力以及多种促纤维化基因的上调。上述结果表明，高刚度刺激下巨噬细胞条件培养基诱导的NSFs表型重塑依赖于MCT1介导的乳酸转运。

为进一步验证乳酸在该过程中的关键作用，采用LDHA抑制剂oxamate降低高刚度培养巨噬细胞的乳酸生成。结果显示，巨噬细胞乳酸生成减少后，其条件培养基诱导NSFs表型重塑的能力显著减弱。与此同时，AZD3965也可缓解TGF-β刺激巨噬细胞条件培养基所诱导的NSFs纤维化反应。相比之下，无论是高刚度刺激还是TGF-β刺激，内皮细胞来源条件培养基对成纤维细胞纤维化标志物表达均影响甚微。综合上述结果表明，在HS微环境中，巨噬细胞糖酵解增强并产生乳酸，MCT1则介导巨噬细胞来源乳酸进入成纤维细胞，进而促进其表型重塑和纤维化进程。

图3：巨噬细胞来源的乳酸积累通过MCT1促进皮肤真皮成纤维细胞表型重塑。

为探究乳酸水平升高促进瘢痕形成的机制，研究检测了HS组织和正常皮肤（NS）组织的蛋白质乳酸化修饰水平。研究发现，HS组织中全局乳酸化水平明显升高，其中组蛋白乳酸化变化尤为突出。在多个已知组蛋白乳酸化位点中，仅H3K23la表现出显著上调，且其水平随外源乳酸浓度增加而呈剂量依赖性升高，提示H3K23la是乳酸介导的重要表观遗传响应位点。

细胞定位分析进一步表明，H3K23la的异常升高主要发生于HS中的肌成纤维细胞，而在内皮细胞和巨噬细胞中变化并不明显。原代细胞检测结果同样证实，HS来源成纤维细胞中Pan Kla和H3K23la显著升高。由此可见，H3K23la可能是连接乳酸积累与肌成纤维细胞表型重塑的重要表观遗传修饰。

图4：在HS肌成纤维细胞中，组蛋白乳酸化水平升高，且H3K23la水平特异性增加。

既往研究已证实，MCT1可介导巨噬细胞来源乳酸向成纤维细胞转运，并促进其向肌成纤维细胞分化。P300作为一种组蛋白乙酰转移酶，近期研究提示其也可能参与组蛋白乳酸化修饰。研究将MCT1沉默不仅降低了HSFs中纤维化标志物的表达，还显著下调了H3K23la水平，并抑制细胞增殖和迁移，提示MCT1可能通过介导乳酸摄取影响组蛋白乳酸化，从而驱动成纤维细胞表型重塑。P300沉默产生了与MCT1沉默高度相似的效应。上述结果提示，MCT1不仅参与乳酸转运，还可能通过调控组蛋白乳酸化促进HS中成纤维细胞的表型重塑。而P300可能作为组蛋白乳酸化的潜在“写入酶”，通过调控H3K23la等乳酸化修饰促进HS成纤维细胞的促纤维化进展。

为探讨H3K23la在增生性瘢痕中的功能意义，研究采用CUT&Tag实验。结果显示，与正常皮肤相比，HS组织中H3K23la峰显著富集，HS组织中启动子区域共有 2,313个乳酸化上调峰，而仅有 49个下调峰，提示H3K23la在HS中主要表现为启动子区域的增强富集，可能参与转录激活调控。GO和KEGG富集分析发现，这些峰显著富集于碳水化合物衍生物生物合成、成纤维细胞迁移正调控、含胶原的细胞外基质以及TGF-β信号通路等与糖酵解、细胞外基质沉积和瘢痕形成密切相关的生物学过程和信号通路。与此同时，RNA-seq分析显示，对上调差异表达基因进行富集分析后发现，其富集通路与CUT&Tag结果高度一致，进一步提示H3K23la可能通过促进纤维化相关基因转录参与HS病理进程。

将CUT&Tag与RNA-seq数据进行联合分析，共筛选出 21个在HS中同时表现为启动子区H3K23la显著增强且mRNA表达显著上调的候选靶基因。结合TGF-β信号通路及细胞外基质相关富集结果，研究重点关注了 HEY2 和 COL11A1。CUT&Tag峰图显示，这两个基因启动子区域的H3K23la信号在HS组织中均明显增强；ChIP-qPCR进一步证实，HS组中HEY2和COL11A1启动子区域均存在显著更高的H3K23la富集。RT-qPCR、Western blot、IHC和免疫荧光显示HEY2和COL11A1在HS组织中高表达。综上所述，这些结果表明，H3K23la可能通过表观遗传方式上调HEY2和COL11A1表达，从而促进HS的发生发展。

图5. H3K23la在HS中激活HEY2和COL11A1的转录。

研究进一步鉴定了HEY2和COL11A1作为HS肌成纤维细胞中的重要效应分子。二者在HSFs中显著高表达，并主要定位于α-SMA阳性肌成纤维细胞，与前期观察到的H3K23la升高具有一致性，提示它们可能是乳酸-H3K23la轴调控下游的关键分子。功能实验表明，无论敲低HEY2还是COL11A1，均可显著降低纤维化标志物表达，并抑制HSFs的迁移和增殖能力，说明二者在维持HS成纤维细胞病理活化状态中发挥重要作用。

图6. HEY2和COL11A1的高水平表达与成纤维细胞的表型重塑相关。

在明确HEY2是H3K23la介导的重要下游靶基因后，研究进一步发现HEY2可作为转录因子直接调控YAP1表达。数据库预测和ChIP-qPCR结果共同证实，HEY2能够结合YAP1启动子区域，从而促进YAP1转录激活。考虑到YAP1是Hippo通路关键效应分子，并可与SMAD通路协同放大促纤维化信号，这一发现为HEY2参与HS进展提供了重要机制依据。

此外，HEY2沉默可显著抑制YAP1、SMAD2及P-SMAD2的表达，并减弱α-SMA等纤维化标志物信号，提示HEY2通过 YAP1/SMAD2 通路促进成纤维细胞活化和瘢痕形成。由此可见，HEY2不仅是H3K23la调控的关键转录靶基因，也是连接表观遗传修饰与促纤维化信号通路激活的重要中介分子。

图7.HEY2通过上调YAP1表达促进成纤维细胞表型重塑。

研究进一步揭示了COL11A1在HS中的功能并不局限于细胞外基质成分本身，而是可能作为代谢调控节点参与乳酸转运放大过程。通过BioGRID预测、Co-IP验证以及免疫荧光共定位分析，研究证实COL11A1可与MCT1发生直接相互作用，且该相互作用在HS肌成纤维细胞中明显增强。分子对接与动力学模拟结果进一步提示，COL11A1可稳定MCT1构象并增强其对乳酸的结合能力，从而提高乳酸转运效率。功能实验中，COL11A1蛋白水平升高伴随HSFs胞内乳酸积累增加，也支持这一观点。更重要的是，前期结果已证实乳酸可诱导H3K23la升高，而H3K23la又可促进COL11A1表达。因此，COL11A1通过增强MCT1介导的乳酸转运，可能与乳酸-H3K23la轴共同构成正反馈环路，持续放大HS成纤维细胞的促纤维化表型。

图8. COL11A1通过与MCT1的联合作用加剧成纤维细胞中乳酸的积累。

为从体内层面验证乳酸-MCT1轴在HS中的作用，研究构建了成纤维细胞特异性Mct1敲除小鼠并建立全层皮肤缺损模型。结果显示，Mct1缺失可明显改善创面修复结局，表现为创面闭合加快、瘢痕样组织学改变减轻、胶原沉积减少及排列更有序，同时伴随I/III型胶原比值下降和毛囊再生迹象增加。相反，外源乳酸处理则加重胶原沉积和组织结构紊乱，延缓创面正常修复。

机制上，Mct1敲除显著降低创面组织中α-SMA和H3K23la表达，并抑制Col11a1和Hey2等前述乳酸化下游关键分子的表达。原代成纤维细胞实验进一步证实，外源乳酸可诱导纤维化标志物、H3K23la及多种促纤维化基因上调，而Mct1缺失可有效阻断这一过程。上述结果表明，乳酸通过MCT1进入成纤维细胞后，可通过提升H3K23la并激活致纤维化转录程序，推动病理性瘢痕形成；而阻断MCT1则有望促使创面修复向更再生性、非瘢痕化方向转变。

图9：在C57雄性小鼠伤口模型中，成纤维细胞MCT1特异性敲除可加速伤口愈合并改善胶原沉积。

小鼠的药物学和细胞来源清除实验进一步支持乳酸-MCT1轴在增生性瘢痕中的关键作用。MCT1抑制剂AZD3965可显著改善创面愈合结局，减少胶原沉积，改善胶原排列，并抑制α-SMA阳性肌成纤维细胞活化；而外源乳酸则可削弱这一保护作用，提示AZD3965主要通过阻断乳酸转运发挥抗纤维化效应。另一方面，清除巨噬细胞可显著降低创面后期乳酸分泌，并减轻瘢痕形成，说明巨噬细胞可能是病理性乳酸积累的重要来源。上述结果共同表明，阻断乳酸供给或抑制其跨膜转运，可能成为增生性瘢痕治疗的有效策略。

图10. MCT1的药理学抑制作为瘢痕治疗策略。

综上，研究揭示了增生性疤痕中，处于高硬度微环境的巨噬细胞通过糖酵解产生大量乳酸，后者经转运蛋白MCT1进入成纤维细胞，驱动组蛋白H3K23位点发生乳酸化修饰，进而激活促纤维化基因HEY2和COL11A1的表达，最终形成自我强化的正反馈环路，导致病理性纤维化。研究重新定义了HS中巨噬细胞-成纤维细胞的互相作用，并确立了MCT1-H3K23la-HEY2/COL11A1轴作为新的治疗靶点。

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