Nat Commun项目文章 | ATAC-seq助力解析转录因子SREBP1介导的脂肪生成通过表观遗传重塑促进血管平滑肌细胞的去分化和衰老

太空微重力环境，为什么会让宇航员的血管“未老先衰”？今天我们分享的这篇发表在Nature Communications的研究论文“SREBP1-mediated lipogenesis promotes dedifferentiation and senescence of vascular smooth muscle cells through epigenetic remodeling”正是以这个为切入点。研究发现乙酰辅酶A（Ac-CoA）的积累及其对SREBP1介导的脂肪生成的后续调控作用，还证实了染色质可及性的改变在血管衰老过程中起关键作用。爱基百客为该研究提供ATAC-seq的技术支持。

无论是真实还是模拟的微重力环境，都会在人类和动物实验中引发类似衰老的颈动脉改变，但其具体机制尚未完全阐明。该研究旨在阐明SREBP1（固醇调节元件结合转录因子1）介导的脂质生成在微重力诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）衰老和去分化中的作用，重点探讨其通过Ac-CoA池调控组蛋白乙酰化、重塑染色质可及性的分子机制，为空间探索中的血管保护及地面血管衰老相关疾病的治疗提供新靶点。

研究分别从大鼠模型（HU模型）和细胞实验（SM模型）上模拟微重力环境，大鼠颈动脉的结构出现了存在衰老样结构重塑——血管中膜变得紊乱，弹性蛋白断裂，血管壁变厚了（虽然管腔直径正常）；负责让血管收缩的基因（如Acta2、Tagln等）表达下降了，而与衰老相关的基因和分泌物（SASP）却大量增加；大鼠颈动脉中的β-半乳糖苷酶活性升高。

在小鼠主动脉平滑肌细胞构建模型（SM模型），表现出与大鼠模型一致的衰老样转化，包括收缩基因的下调和衰老或SASP基因的上调。研究对老鼠血管和细胞进行了RNA-seq，结果显示在微重力下，平滑肌细胞原本应该进行的正常工作（如分化、增殖、收缩）被严重抑制了。这些研究结果共同表明，模拟微重力会导致颈动脉VSMC发生衰老样转化。

图1：模拟微重力导致颈动脉VSMC发生衰老样重塑。

研究把老鼠（HU模型）和细胞（SM模型）的基因数据放在一起比对，寻找它们在微重力下共同发生的变化。基于KEGG相关的GSEA分析发现，那些负责“脂质代谢”（比如脂肪酸合成、胆固醇合成）的基因通道被异常地大量激活了；相反，负责细胞骨架和血管收缩的通道被严重抑制了。通过透射电子显微镜清晰地看到了微重力细胞内部堆积了大量的“脂滴”。荧光染色进一步确认了这些发光的就是脂肪。为了证明这不仅是在某一种细胞里发生，研究测试了小鼠细胞、大鼠原代细胞，甚至人类的主动脉平滑肌细胞，结果全都一样——在模拟微重力下，细胞内的脂肪酸（FA）和甘油三酯（TG）都显著增加了，出现了明显的脂质堆积。

此外，研究通过脂质组学对颈动脉的脂质状态进行了表征，大鼠颈动脉里最主要的脂质本来是甘油三酯、脂肪酸和磷脂酰胆碱；处于微重力下的大鼠，其颈动脉内的多种脂质成分全面超标，包括脂肪酸、胆固醇酯、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯等。综上所述，这些数据表明SM可诱导颈动脉VSMC脂质蓄积。

图2：模拟微重力可诱导颈动脉及VSMC脂质蓄积。

基于GSEA进行转录组分析，对HU和SM模型中激活的转录因子进行富集分析。HU和SM模型中分别有75和102个转录因子显著富集，其中21个转录因子在HU和SM模型中共同富集。其中，SREBP1赫然在列。由于，SREBP2和SREBP1具有相似的DNA结合基序，推测其可能在SM过程中被激活。

免疫组化和免疫荧光显示微重力大鼠颈动脉的“血管平滑肌细胞”里，SREBP1和SREBP2的信号确实大幅增加了。SREBP1信号增强主要分布于VSMC。Western blot进一步证实，与对照组相比，HU大鼠中前体SREBPs（p-SREBPs）和核内SREBPs（n-SREBPs）的蛋白表达均有所增加。在平滑肌细胞（MOVAS和HASMC）中，同样看到了SREBPs被激活的现象。而且非常有意思的是，作为对照组的内皮细胞（HUVEC）依然毫无反应——这再次印证了，微重力对血管平滑肌的伤害是非常特异的。鉴于mTOR信号通路在激活SREBP1、机械转导及细胞衰老中的关键作用已得到充分证实，进一步实验也证实了mTOR通路的激活。所有这些结果表明，SREBPs的激活促进了SM诱导的颈动脉和VSMC的脂质蓄积。

图3：模拟微重力可激活SREBPs介导的脂肪生成。

鉴于SREBP1和SREBP2在脂质稳态调节中的作用存在差异，研究尝试探究它们对VSMC生物学功能的潜在贡献差异。基于人类动脉粥样硬化患者的数据集，SREBPs靶基因与衰老基因呈正相关，与VSMC收缩基因呈负相关。值得注意的是，这些相关性主要归因于SREBP1靶基因，而SREBP2靶基因的影响较小。为了确认谁发挥功能，研究人员用siRNA技术，分别把细胞里的SREBP1和SREBP2给敲低了。当把SREBP1敲低后，细胞不仅没有变差，反而收缩能力变强了；但如果把SREBP2敲低，细胞的收缩能力反而变弱了。

为了确定SREBP1激活是否直接导致VSMC的衰老样转化，使用一种叫LXR-623的靶向激动剂（只激活SREBP1）。给药后细胞的RNA测序结果，竟然和之前处于模拟微重力（SM）下的细胞测序结果高度重合。形态层面：显微镜下，被LXR-623处理过的细胞同样也呈现脂质蓄积。细胞的收缩能力下降，代表衰老的β-半乳糖苷酶活性极度升高，甚至连上游的mTOR信号通路也被连带激活了。

图4：SREBP1通过激活脂肪生成直接促进VSMC的衰老样转化。

脂肪合成过程中会产生一个核心中间产物——乙酰辅酶A（Ac-CoA）。研究发现，在微重力或单独激活SREBP1后，细胞质和细胞核里的Ac-CoA浓度异常飙升，而作为内源性Ac-CoA合成关键底物的柠檬酸水平则显著下降。Ac-CoA 可不仅仅是代谢物，它还可以通过蛋白质（特别是组蛋白）的乙酰化来调控基因表达。研究通过IP-MS对LXR-623或SM处理的MOVAS细胞中的乙酰化蛋白质谱进行了表征，其中组蛋白被大量且过度乙酰化（特别是H3K9、H3K18、H3K27等位点）。

为了证明就是Ac-CoA直接在VSMC的衰老样转化中发挥作用，研究添加外源性Ac-CoA（NaAc）或者用抑制剂阻止去乙酰化（DaIC）应用于MOVAS细胞，结果LXR-623诱导的血管平滑肌细胞的衰老急剧恶化；甚至补充NaAc部分抵消Srebf1敲低的影响。这一观察结果促使研究检查Acly和Acss2是否上调，它们是SREBP1的两个靶点，也是分别催化由内源性柠檬酸（ACLY）和外源性醋酸盐（ACSS2）生物合成Ac-CoA的关键酶。值得注意的是，Acly或Acss2敲低均显著减轻了SM诱导的VSMC脂质积累和细胞衰老，表现为BODIPY、SPiDER-βGal信号降低和P21表达减少。总之，这些结果表明，上调的Ac-CoA池促进了SREBP1激活引发的VSMC衰老样转化。

图5：上调的乙酰辅酶A池促进SREBP1激活引发的VSMC衰老样转化。

由于SREBP1激活上调了细胞内乙酰辅酶A池并导致组蛋白乙酰化水平升高，研究随后探究了染色质可及性是否参与了MOVAS的衰老样转化。研究对经DMSO、 LXR -623、DMSO+DaIC或LXR -623+DaIC处理的MOVAS进行了ATAC-seq。ATAC-seq结果共鉴定到69795个peak，大量落在启动子/调控相关区域。聚焦启动子峰，把基因分成8个cluster，重点关注Cluster5、6和8。Cluster5代表在LXR-623处理后染色质可及性变得更加紧密的基因，而在补充DaIC后紧密程度进一步加剧。富集通路（KEGG/GO）：主要是细胞骨架/肌动蛋白调控、MAPK、肌细胞骨架等；并涉及血管重塑、动脉发育、平滑肌分化/迁移等过程。相反，Cluster6和Cluster8代表在LXR-623处理后染色质可及性变得更加开放的基因，而在补充DaIC后开放程度更高。富集通路：主要有表观遗传/染色质重塑（ATP依赖染色质重塑等）、衰老相关（细胞衰老、细胞周期、凋亡等）和脂质代谢/动脉粥样硬化相关（脂质生物合成、酰基转移酶活性等）。分析进一步聚焦关键基因位点。收缩标志基因（如Acta2）：LXR-623或DaIC都会让其启动子/调控区的可及性降低；LXR-623 + DaIC可能出现协同效应，关得更明显。衰老基因（如 Cdkn1a/p21）：LXR-623或DaIC都会让其可及性打开，二者合用同样有协同，开得更明显。

为了深入了解SREBP1激活上调引发VSMC去分化的潜在机制，研究进行了转录因子（TF）富集分析，并将其与RNA-seq的分析结果进行了比较。TF富集分析表明，血清响应因子（SRF）作为三个核心转录因子之一，可能参与了VSMC收缩命运的抑制。基于GSEA分析，在该研究进行的三种转录组学比较（CON对比HU；CTRL对比SM；DMSO对比LXR-623）中，SRF也是导致基因下调的核心转录因子。进一步的结果表明，LXR-623或SM处理抑制了SRF和MYOCD（SRF的转录协调因子）的核转位，这可能导致了SRF的功能抑制。此外，下调的SRF靶基因主要富集在肌动蛋白细胞骨架组织、肌肉结构发育以及对机械刺激的反应中，这些因素促成了SREBP1激活和模拟微重力所引起的VSMC分化命运的抑制。综上所述，这些数据揭示了上调的Ac-CoA池通过重塑染色质可及性触发了VSMC的衰老样转化。

图6：上调的乙酰辅酶A池通过重塑染色质可及性触发VSMC表型转化。

研究者基于“模拟微重力（SM）通过激活SREBP1上调Ac-CoA代谢池并重塑染色质可及性、进而诱导VSMC衰老样转化”的发现，进一步采用慢病毒敲低Srebf1（Lv-sh-Srebf1）进行干预验证：在RCA-SMCs中，Srebf1敲低显著下调Srebf1及其靶酶Acly/Acss2和衰老相关基因表达，并降低ACLY、ACSS2、P21及组蛋白H3乙酰化水平，从而缓解SM诱导的Ac-CoA升高并部分恢复细胞收缩表型（α-SMA、收缩力改善）。在体内方面，利用Laponite水凝胶实现颈动脉局部递送Lv-sh-Srebf1，可有效转导血管壁VSMC并减轻后肢悬吊（HU）导致的颈动脉cIMT增厚（不影响管腔直径）、中膜衰老样紊乱及弹力纤维断裂，同时部分降低HU诱导的血管Ac-CoA水平并纠正Srebf1、Acta2、Tagln、Cdkn1a、Tp53以及P21、Pan-Ac等分子异常；进一步在小鼠中采用VSMC特异性的AAV-Tagln-sh-Srebf1并结合水凝胶局部递送，获得一致的结构与分子层面保护效应。总体而言，Srebf1敲低在功能与形态学上均可部分逆转SM/HU诱导的颈动脉衰老样重塑，提示SREBP1具有关键病理学作用及潜在治疗价值。

图7：敲低Srebf1可减轻模拟微重力诱导的VSMC衰老样转化。

综上，该研究表明SREBP1激活会诱导脂肪生成，触发VSMC衰老，并促进颈动脉对模拟微重力（SM）的适应。这些观察结果基于对后肢卸载（HU）大鼠和二维旋转VSMC模型的研究。研究还证实，作为SREBP1公认的激动剂，LXR-623促使VSMC发生衰老样转化，而沉默SREBP1则产生相反的作用。机制上，研究发现SREBP1上调了细胞内乙酰辅酶A（Ac-CoA）池和组蛋白乙酰化水平，从而重塑了收缩及衰老相关基因的染色质可及性。在体外和体内，Srebf1敲低均显著减弱了VSMC的衰老样转化。因此，该研究结果深入揭示了脂质稳态在VSMC生物学中的病理生理作用，为与脂质相关的血管疾病提供了治疗选择。

图8：微重力应激促进血管平滑肌细胞去分化与衰老的原理图。

项目咨询