项目文章 | CUT&Tag助力解析单原子纳米酶驱动乳酸逆转促进氧化代谢、抑制组蛋白乳酸化调控糖尿病伤口愈合的机制

长期以来，乳酸被视为糖酵解的终末代谢产物，其病理意义主要被框定于“代谢废物”与“酸中毒诱因”的范畴。然而，随着表观遗传学研究的深入，乳酸通过组蛋白乳酸化修饰（histone lactylation）调控基因转录的新功能被逐步揭示——这一发现彻底重塑了学界对乳酸生物学角色的认知，也为代谢性疾病干预开辟了全新维度。

2026年2月27日，重庆医科大学陈陶教授与刘南新教授合作团队在《ACS Nano》（IF=16.1）发表题为“Single-Atom Nanozyme Driven Lactate Reversal Fuels Oxidative Metabolism and Represses Lactylation to Heal Diabetic Wounds”的研究论文，创新性地将单原子纳米酶（single-atom nanozyme）的电子结构工程与乳酸代谢重编程相结合，提出“逆转-再利用”（reversal-reutilization）的乳酸调控策略，为糖尿病慢性伤口的代谢-表观遗传协同治疗提供了突破性解决方案。（爱基百客为本文提供CUT&Tag技术支持）

研究背景与核心问题

糖尿病慢性伤口是困扰全球数亿患者的严重并发症，其难以愈合的核心机制在于局部持续存在的促炎微环境。传统治疗策略多聚焦于单一靶点，或调控代谢，或干预表观遗传，难以实现根本突破。该研究团队敏锐地意识到：乳酸作为连接细胞代谢与表观遗传修饰的关键节点分子，或许是破解这一困境的“阿基米德支点”。

然而，天然乳酸氧化酶（LOX）稳定性差、成本高昂，难以临床转化；更重要的是，既往研究往往将乳酸氧化产物丙酮酸视为代谢终末产物而忽视，未能建立“乳酸清除-能量再利用"的完整代谢闭环。如何设计一种既能高效催化乳酸氧化、又能促进丙酮酸进入三羧酸（TCA）循环重新利用的人工催化系统，成为本研究要解决的核心科学问题。

研究材料

• 临床样本：糖尿病患者愈合/未愈合伤口皮肤组织（GSE165816单细胞测序数据）

• 细胞模型：RAW 264.7巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）

• 动物模型：STZ诱导的糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染模型（金黄色葡萄球菌感染）

• 纳米材料：磷掺杂单原子铁纳米酶（Fe@CN-P）及对照材料Fe@CN

研究路线

研究结果

1.糖尿病慢性伤口中巨噬细胞代谢的单细胞分析

为探究临床糖尿病慢性伤口持续不愈合的病理因素，研究团队通过分析GEO数据库的单细胞测序数据集GSE165816（图2A），对比糖尿病患者愈合（DFU-healing）与未愈合（DFU-nonhealing）伤口皮肤组织，经UMAP分析明确样本细胞组成（图2B）后，通过AddModule-Score法评分发现未愈合组氧化应激和线粒体功能障碍评分显著更高（图2C），且巨噬细胞的氧化应激水平最高并与伤口愈合通路密切相关（图2D-2F）；进一步研究显示，未愈合组中促炎（M1）巨噬细胞以糖酵解为主导代谢模式，其糖酵解关键限速酶LDHA表达显著高于抗炎（M2）巨噬细胞（图2G），导致细胞内乳酸积累，临床样本免疫荧光染色也证实糖尿病慢性伤口组织中巨噬细胞LDHA（乳酸脱氢酶A）表达高于正常皮肤（图2H），而对美国NHANES数据库940名参与者的数据过滤和筛选后（图2I），经单/多因素及分段logistic回归分析验证了LDH水平与糖尿病足溃疡发生呈正相关（图2J(i)、2J(ii)）。这些发现揭示了“氧化应激-线粒体损伤-糖酵解增强-乳酸堆积-炎症持续”的恶性循环是糖尿病伤口难愈的关键病理机制。

2. Fe@CN-P的设计、合成与结构表征

基于上述病理机制，研究团队设计并合成了磷掺杂单原子铁纳米酶（Fe@CN-P），采用“掺杂-吸附-磷化”策略（图3A）：

• 形貌特征：TEM（透射电子显微镜）显示均匀无颗粒形态，HR-TEM（高分辨率透射电子显微镜）和HAADF-STEM（高角度环形暗场扫描透射电子显微镜）证实铁以单原子形式分散（图3B-D）；

• 元素分布：EDS mapping（能量色散X射线光谱）显示Fe、N、P、C、O均匀分布（图3E）；

• 结构确认：XRD（X射线衍射）无晶体铁相衍射峰，Raman（拉曼光谱）显示P掺杂增加无定形碳比例（图3F-G）；

• 电子态分析：XPS（X射线光电子能谱）显示Fe@CN-P中Fe 2p结合能负移，表明P掺杂增加了Fe中心电子密度（图3I）；

• 配位环境：EXAFS（扩展X射线吸收精细结构）拟合确认Fe-N₃P₁配位结构，波函数变换（WT）分析进一步验证单原子分散特征（图3K-L）。

3. 多酶活性与DFT理论验证

在明确Fe@CN-P的微观结构与电子特性后，研究团队进一步系统评估其多酶催化活性，重点探究磷掺杂修饰及环境pH值对催化性能的调控作用，同时结合密度泛函理论（DFT）计算，从实验与理论层面双重验证其催化机制的合理性。实验结果表明，Fe@CN-P具备浓度依赖性的多酶模拟活性，可同时模拟过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及乳酸氧化酶（LOX）的催化功能；与未进行磷掺杂的Fe@CN相比，磷掺杂带来的电子结构不对称效应显著提升了其仿酶活性，动力学分析进一步证实，Fe@CN-P对各底物的亲和力（Km值）及催化效率（kcat/Km值）均优于Fe@CN，其中SOD样活性的提升尤为明显（图4A~D）。值得注意的是，Fe@CN-P具有pH响应性催化特性，在酸性环境（模拟糖尿病感染伤口微环境）下，其POD样活性达到峰值，可高效产生活性氧（ROS）发挥抗菌作用；而在中性环境（伤口修复阶段），则以SOD-CAT级联反应为主，高效清除过量ROS以缓解氧化应激，这种功能切换完美适配糖尿病伤口“感染-修复”的动态病理进程。此外，Fe@CN-P可高效催化L-乳酸氧化生成丙酮酸，且在较宽pH范围内均能维持稳定的LOX样活性，其活性随pH升高呈增强趋势。为从分子层面阐明上述催化特性的本质，研究团队通过DFT计算进行理论验证，结果显示，磷掺杂可显著提升Fe@CN-P中Fe活性中心的电子密度，使Fe d带中心从Fe@CN的-0.899 eV下移至-0.987 eV，大幅降低了乳酸脱氢反应的能垒，从理论上明确了磷掺杂调控Fe@CN-P催化效能的核心机制（图4F~J）；同时，电子自旋共振检测及产物定量分析等实验，进一步佐证了Fe@CN-P的催化特异性及产物生成效率，证实其可高效实现乳酸向丙酮酸的转化（图4E）。

4.Fe@CN-P的体外抗炎与抗菌效应

在验证Fe@CN-P良好生物相容性的基础上（体外细胞毒性、血液相容性及体内器官安全性均达标，材料稳定性优异且磷泄漏量极低），研究团队进一步探究其体外抗炎与抗菌效能。采用LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞建立氧化应激与慢性炎症模型，CCK-8实验证实Fe@CN-P在50μg/mL浓度内对巨噬细胞无明显毒性，RT-qPCR与Western blot实验明确2μg/mL为其发挥抗炎作用的最适浓度，可显著下调促炎因子IL-1β、IL-6的表达，同时上调抗炎因子IL-10的水平（图5A-B）。

DCFH-DA探针检测显示，Fe@CN-P可显著清除LPS诱导产生的细胞内过量ROS，缓解氧化应激（图5C）。巨噬细胞表型转换实验中，流式细胞术、免疫荧光及Western blot结果均表明，Fe@CN-P可抑制M1型巨噬细胞标志物（iNOS/CD86）的表达，同时促进M2型巨噬细胞标志物（CD206）的表达，成功将巨噬细胞从促炎表型重编程为修复表型，打破炎症持续循环（图5D-G）。

抗菌实验中，Fe@CN-P对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）和大肠杆菌（革兰氏阴性菌）均表现出浓度依赖性抗菌效果，菌落计数与Live/Dead染色证实其可显著降低细菌存活率（图5H-I）；TEM观察显示，Fe@CN-P处理后细菌出现明显的细胞膜皱缩、破裂，表明其通过SOD-POD级联反应产生大量高毒性·OH，破坏细菌细胞壁与细胞膜完整性，从而发挥强效抗菌作用（图5J）。

5.Fe@CN-P通过恢复线粒体功能调控代谢重编程

为进一步阐明Fe@CN-P对巨噬细胞的调控机制，研究团队对LPS处理组与LPS+Fe@CN-P处理组巨噬细胞进行转录组测序（RNA-seq），结果显示Fe@CN-P可显著下调炎症相关通路（如TNF信号通路）及关键促炎基因（IL1α、IL1β）的表达，进一步佐证其抗炎效应（图6A-B）。结合前文发现的乳酸堆积与线粒体功能异常，研究团队聚焦线粒体功能与代谢重编程的调控作用（图6C）。

MitoSOX染色结果表明，Fe@CN-P可显著减少LPS诱导的线粒体ROS（MitoSOX）积累，减轻线粒体氧化损伤（图6D）；JC-1荧光染色显示，Fe@CN-P可逆转LPS诱导的线粒体膜电位下降，恢复受损的线粒体功能（图6E）；MitoTracker染色观察到，LPS处理组线粒体呈点状碎片化，而Fe@CN-P处理组线粒体恢复为正常的长管状形态，证实其可改善线粒体质量（图6F）。

Western blot分析显示，LPS处理可显著降低三羧酸循环（TCA）关键酶IDH2的表达，同时升高糖酵解关键酶LDHA、HK2的表达，而Fe@CN-P处理可逆转上述代谢酶的异常表达（图6G-H）；细胞ATP检测证实Fe@CN-P可恢复LPS诱导的细胞能量代谢紊乱，提升ATP水平；TEM观察发现Fe@CN-P可定位于巨噬细胞胞质与线粒体中，为其调控线粒体功能提供了结构基础。此外，细胞内乳酸检测显示，Fe@CN-P可显著降低LPS诱导的乳酸积累，这一效应既源于其对细胞代谢功能的调控，也得益于其LOX样活性对乳酸的直接氧化作用（图6I），实现了乳酸的“逆转-再利用”。

6.Fe@CN-P通过抑制H3K18la介导表观遗传重塑

鉴于Fe@CN-P可显著调控细胞内乳酸水平，而乳酸作为组蛋白乳酸化修饰的关键供体，研究团队进一步探究其对巨噬细胞表观遗传的调控作用。Western blot实验证实，Fe@CN-P可显著降低巨噬细胞内总组蛋白乳酸化（Pan-kla）水平，与乳酸水平的变化趋势一致（图7B）；进一步分析关键乳酸化位点发现，H3K18la（组蛋白H3第18位赖氨酸乳酸化）是Fe@CN-P调控的核心位点，LPS诱导可显著上调H3K18la表达，而Fe@CN-P处理可有效抑制该效应（图7D），免疫荧光染色进一步验证了这一结果（图7C、E）。

临床样本验证显示，糖尿病慢性伤口组织中巨噬细胞（CD68阳性）的H3K18la表达水平显著高于健康人皮肤组织，提示H3K18la异常升高与糖尿病伤口难愈密切相关（图7F）。外源性乳酸救援实验证实，在Fe@CN-P与LPS共处理体系中加入外源性乳酸，可显著恢复Pan-kla与H3K18la的表达水平（图7G-H），同时逆转Fe@CN-P诱导的巨噬细胞向M2表型极化的效应（图7I）。上述结果表明，Fe@CN-P通过降低细胞内乳酸积累，进而抑制H3K18la水平，是其缓解巨噬细胞介导的炎症反应的关键表观遗传机制。

7.CUT&Tag揭示下游靶基因：FGR、IL-1α、MMP9

组蛋白乳酸化修饰主要通过调控靶基因转录发挥生物学功能，为明确H3K18la的下游调控靶点，研究团队整合CUT&Tag（爱基百客提供）与RNA-seq数据，筛选Fe@CN-P调控的H3K18la下游靶基因（图8A）。CUT&Tag分析显示，与LPS组相比，LPS+Fe@CN-P组巨噬细胞的H3K18la结合峰显著富集，且H3K18la结合位点主要分布于基因转录起始位点（TSS）附近（图8B-C）。

通过Venn图分析CUT&Tag与RNA-seq的差异结果，筛选出FGR（Fgr激酶）、IL-1α（白细胞介素-1α）、MMP9（基质金属蛋白酶9）三个核心靶基因（图8D），IGV轨迹图证实Fe@CN-P处理可显著降低H3K18la在这三个基因启动子区域的结合水平（图8E）。Western blot与RT-qPCR实验进一步验证，Fe@CN-P可显著下调LPS诱导的FGR、IL-1α、MMP9的mRNA及蛋白表达水平（图8F-G）。

功能分析表明，FGR可促进细胞内过量ROS生成，IL-1α是促炎反应的关键启动因子，MMP9可过度降解细胞外基质、延长组织损伤，三者共同参与糖尿病伤口的炎症持续与组织修复障碍。外源性乳酸挽救实验显示，补充外源性乳酸可恢复FGR、IL-1α、MMP9的表达水平（图8H），进一步证实Fe@CN-P通过抑制H3K18la，下调上述靶基因表达，从而发挥抗炎与组织修复调控作用。

8. 体内治疗效果验证：Fe@CN-P加速慢性糖尿病伤口体内愈合

为验证Fe@CN-P的体内治疗效能，研究团队建立STZ诱导的糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染模型（金黄色葡萄球菌接种形成生物膜），将小鼠随机分为对照组、感染组、GelMA组、Fe@CN-P+GelMA组，以GelMA为载体实现Fe@CN-P在伤口局部的稳定释放。

体内实验结果显示，与其他组相比，Fe@CN-P+GelMA组小鼠的伤口愈合速率显著加快，伤口闭合率明显提高；菌落计数实验证实，Fe@CN-P可有效清除伤口局部的金黄色葡萄球菌，降低细菌定植量，缓解伤口感染。组织学分析显示，Fe@CN-P+GelMA组伤口组织的炎症细胞浸润显著减少，肉芽组织增生更明显，胶原纤维排列更规整（H&E染色与Masson三色染色）；免疫荧光染色证实，Fe@CN-P可显著下调伤口组织中FGR、IL-1α、MMP9的表达，同时促进血管生成标志物CD31的表达，改善伤口局部血供。

上述体内实验进一步验证了Fe@CN-P在糖尿病慢性伤口治疗中的有效性，其通过“抗菌-抗炎-代谢重编程-表观遗传调控”的多维度协同作用，打破糖尿病伤口的病理恶性循环，加速伤口愈合，为其临床转化奠定了坚实基础。

研究亮点与创新性

概念创新

首次提出“逆转-再利用”（reversal-reutilization）的乳酸调控策略，突破传统“单纯清除"的局限，实现代谢废物向能量底物的转化。

材料创新

通过P掺杂精准调控Fe单原子电子结构（d带中心下移），赋予纳米酶高效的乳酸氧化酶（LOX-like）活性，解决了金属基纳米酶难以催化C-H键活化的难题。

机制创新

建立“乳酸代谢-组蛋白乳酸化-基因转录”的完整调控链条，整合CUT&Tag与RNA-seq技术系统鉴定下游靶基因。

治疗模式创新

pH响应性多酶级联活性实现“先杀菌、后修复”的智能时序调控，契合慢性伤口病理进程的动态需求。

研究意义与展望

本研究为单原子纳米酶的生物应用提供了重要范式：原子级电子结构工程可赋予纳米酶精准调控复杂生物代谢过程的能力，打破了纳米酶“仅模拟酶催化”的传统认知。Fe@CN-P不仅是一种潜在的糖尿病伤口治疗制剂，其“代谢-表观遗传协同调控”策略，更为代谢性疾病（如肿瘤、自身免疫病、神经退行性疾病等）的纳米酶干预策略开辟了新的研究方向。