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一起来学ChIP吧(一):ChIP技术的几个要点

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一起来学ChIP吧(一):ChIP技术的几个要点

发布日期:2018-09-27 作者: 点击:

1. 关于细胞

       细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。

       一般细胞长到75%-80%比较好。


2. 关于抗体

      抗体是实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的抗体,另外如果经济条件许可的话,尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体,即使是IP级别的。

      单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域),选择多抗比较稳妥一些。


3. 关于交联与超声破碎

      这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

      交联不充分,只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合,富集得到的Promoter的量不高,实验假阴性。交联过充分,基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

      一般来讲,交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如:NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下15min,1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器,那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。

 

4. 关于操作

      希望尽可能的保持低温(4度)。

      沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500rpm等)离心使其完全沉降。

      虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,我还是希望你能够连续把它做完,直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。


5. 关于解交联

      虽然说明书上说4小时已经足够,但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样环境里,DNA不会降解,过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。


6.关于DNA片段的回收

      需要注意的是:样品中SDS样品较高,普通的PCR产物回收试剂盒回收,很有可能会在最终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。

小Tip:过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除SDS沉淀。

基因表达定量

本文网址:http://www.igenebook.com/news/368.html

关键词:基因表达定量,表观组学技术服务,基因表达调控

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