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一起来学ChIP吧(二):ChIP实验笔记

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一起来学ChIP吧(二):ChIP实验笔记

发布日期:2018-09-27 作者: 点击:

1.cell counting:尽量做到准确,会影响input结果。


2.cross link:甲醛的终浓度是1%,这个基本所有的protocol上都会强调。


3.resuspend cellswith SDS:一定要选用小的tip头,在液面下吹打,否则很容易产生气泡,后面的sonication就麻烦了。


4.sonication:ChIP中重要的一部分,合适的条件要自己摸索,可以一次尝试不同次数的sonication,然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。


5.加入salmon spermDNA/Protein A or G之前要先混匀,因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质,若不混匀,后面你会发现beads的量不一样,自然也会影响实验的结果。


6.wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净,但后一个要尽量吸干净,必要时可用gel loading tips吸。


7.含beads的samples离心时,有的protocol上推荐是1000rpm,45秒,但可以根据情况调整,但要注意转速不能太快防止beads破碎。(当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题)


8.reverse crosslink可以是65°4个小时,也可以overnight。


9.reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心,把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。


10.1每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。


11.1~10ul的枪取3ul以上才比较准确,所以考虑好自己PCR反应体系的配置。


12.一个ChIP一般需要3~4天的时间,其中有几个步骤是可以停下来的:


(1)细胞收集:用含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤离心,去上清的细胞收集液可置-80°冻存;


(2)用SDS重悬细胞后可置-80°冻存;


(3)sonication结束,离心后的上清置新的离心管后可-80°冻存;


(4)reverse cross-link后的标本可-80°冻存。


14.agarose beads 的wash过程中以及后面的DNA提取过程中乙醇的wash,可以用细胞室的那种吸引器,接上200ul的tip头吸,这样会节省很多时间(每个实验室情况可能不一样)。


15.DNA提取后建议用水溶解DNA,因为TE buffer里的EDTA可能会影响PCR反应体系中的Mg2+。


16.溶解DNA的水量可以根据PCR反应体系的要求适当调整。

基因表达调控

本文网址:http://www.igenebook.com/news/369.html

关键词:表观组学技术服务,基因表达调控,基因表达定量

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