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一起来学ChIP吧(四):染色质免疫共沉淀问题手册

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一起来学ChIP吧(四):染色质免疫共沉淀问题手册

发布日期:2018-09-27 作者: 点击:

1. ChIP的靶点

   在您开始ChIP实验之前,您需要了解ChIP靶蛋白的性质,这一点很重要。考虑下列问题:

   您的ChIP靶蛋白是否表达,在哪些条件下表达?

   它是否在信号刺激下发生修饰?

   在感兴趣的条件下,它是否位于细胞核内?

   它是高丰度还是低丰度的靶蛋白?

   它是直接与DNA结合,还是通过蛋白质之间的相互作用?

   它是否与染色质紧密相关,如组蛋白?

   它的分析是单个位点还是多个位点?

       ChIP需要表位高度特异的抗体,它们识别天然染色质状态或可能的交联构象下的蛋白质或感兴趣的修饰残基。因此,有些蛋白质靶点或表位可能更难开展ChIP,因为与其他蛋白质关联,或表位通过其他方式遮蔽。然而,考虑到各种抗体候选,许多核蛋白也是可ChIP的。目前有越来越多的商业抗体,能检测许多关键的ChIP靶点,如组蛋白和组蛋白修饰、转录因子、辅助因子、核酶,以及维持和修复DNA的蛋白质。

2. ChIP中的组蛋白

       组蛋白和经过修饰的组蛋白是丰富、也是广泛研究的ChIP靶点,因为它们经过各种与生物学功能相关联的翻译后修饰。组蛋白家族包括五种亚型:H1、H2(及其变体)、H3和H4。组蛋白H2、3和4形成核小体的核心结构,而H1是连接蛋白,有助于染色质内核小体的组装。组蛋白经历了多种翻译后修饰(PTM):甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、瓜氨酸化、生物素化、巴豆酰化和ADP核糖基化。 

       这些翻译后修饰(PTM)可能改变染色质的结构,让它更难或更容易被转录复合物接近。乙酰基团添加到组蛋白的赖氨酸残基上,这一过程由组蛋白乙酰转移酶(HAT)催化,减少了组蛋白与DNA分子之间的静电相互作用,使得染色质结构不太稳定,更容易被转录复合物接近,从而导致基因激活。相反,组蛋白脱乙酰酶(HDAC)去除这一化学基团,往往实现转录抑制。同样,三个甲基基团也可通过甲基转移酶添加到H2A、H2B、H3和H4的赖氨酸和精氨酸残基上,这取决于所修饰的残基。

       组蛋白的甲基化可以导致基因表达或抑制,这取决于甲基化的位点。例如,组蛋白H3第9和27位赖氨酸的甲基化是异染色质形成的标志,与蛋白质polycomb group的活性相关而,H3第4和36位赖氨酸的甲基化则表示常染色体、基因激活和trithorax蛋白的关联。

       所有组蛋白的多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基都经历了磷酸化,这对于转录、染色质结构、DNA损伤通路和凋亡都有着不同的影响。在有丝分裂过程中,组蛋白H1和H4(第1位丝氨酸)都发生位点特异的磷酸化,而组蛋白H3(第10和28位丝氨酸)的程度更高,这或促进染色质的凝聚和分离,或促进染色质的解聚。特别是,磷酸化组蛋白H3的第10位丝氨酸已经过充分鉴定:它可在G2期到中期检测到,通常作为有丝分裂细胞的标志。此外,组蛋白磷酸化可能在DNA损伤应答通路和凋亡中发挥作用。组蛋白变体H2A.X是第139位的丝氨酸被ATM/ATK激酶磷酸化,以响应双链DNA的断裂,可能引起DNA修复蛋白的招募。这些组蛋白修饰也可能引发组蛋白亚基替换,这涉及到一系列酶和伴侣蛋白。

       总的来说,不同的组蛋白修饰模式,所修饰的组蛋白残基的数量,以及这些修饰的时空关系 – 这些通常被称为“组蛋白密码(histone code)” – 决定了对染色质和DNA的影响。

基因表达调控

3. 样品制备

       目标:为了制备足够量的适用于ChIP实验的培养细胞或组织切片/样品

       ChIP实验可在培养的细胞或组织上开展。在任何情况下,都必须考虑您样品的均质性,因为每个有贡献的细胞类型可能有着不同的染色质结构。同时还必须确定您将要开展多少个ChIP反应。每个ChIP反应所需的细胞数量将取决于蛋白质靶点的丰度。在决定每个ChIP反应所需的“染色质对应的细胞量”时,需要考虑的因素包括您细胞中的可用表位数量,以及您抗体的质量(亲和力和特异性)。如果使用高质量的抗体来靶定高丰度的表位,如RNA聚合酶II及一些类型的组蛋白修饰,每个ChIP只用1x104个细胞也能实现成功富集。当抗体并非很好或每个细胞的表位数很低时,我们建议增加细胞数量。应当根据抗体性能来缩放细胞数量,以优化相对于非特异对照(正常IgG或阴性位置对照)的高信噪比。

       组织样品包含异质的细胞群体,对ChIP而言更具挑战性。可以使用冰冻切片或新鲜组织,切成1-3mm3的切片。ChIP所使用的组织量将取决于组织类型,蛋白质靶点的相对丰度,以及ChIP抗体的可靠性。一般而言,一颗豌豆大小的组织约含107个细胞,足够作为100个ChIP实验的样品。然而,此数值的准确性取决于组织的相对细胞结构和污染的细胞外基质的量。应当小心而迅速地处理组织样品,将样品置于冰上,以保证样品的完整性。

4. 蛋白质与DNA交联

       目标:稳定蛋白质与DNA的体内结合

       交联稳定了蛋白质靶点与相互作用的DNA序列的结合。在某些情况下,蛋白质靶点已与DNA紧密结合,则在实验分析过程中,就不需要其他的化学交联,来保留蛋白质/DNA复合物。这被称为native ChIP,或N-ChIP。N-ChIP适用于组蛋白和组蛋白修饰等靶点。然而,值得注意的是,没有额外交联,核小体上的体内修饰在分析过程中仍时有发生。

       在靶定与DNA结合较弱的蛋白质时,我们强烈建议使用交联ChIP(X-ChIP)的方案。X-ChIP可利用紫外光、甲醛或其他的化学交联剂开展。对于活体样品制备,甲醛交联通常是首选,因为这种修饰是可逆的,让您能分离并扩增ChIP富集的DNA。此外,甲醛的交联距离只有2 Å(0.2 nm),确保您交联的是已经与DNA紧密结合的蛋白质。甲醛也将在DNA结合蛋白和与之相结合的蛋白之间形成交联,有助于蛋白质/DNA间接相互作用的研究。甲醛交联能够承受后续的实验操作,让您能分离出完整的蛋白质/DNA复合物。不过,甲醛有时候会产生非特异的交联。

关键点

标准的甲醛交联条件是1%甲醛在室温下交联10分钟。交联时间至多可延长至20分钟,以促进较弱或间接作用的蛋白质与蛋白质或蛋白质与DNA的分离;

只使用分子生物学级别的甲醛:甲醛是用甲醇稳定的,一旦甲醇蒸发,甲醛可能会形成白色沉淀。请勿使用含有此沉淀的甲醛;

长时间交联可能遮蔽蛋白质靶点的表位,并降低您的ChIP抗体的结合效率;

交联不当可能导致随后操作步骤中您的蛋白质/DNA复合物的损失;

在交联试剂处理过程中,细胞或组织的条件需要考虑(即存在培养基 vs. 磷酸盐缓冲液)。培养基包含的分子可能与甲醛相互作用,潜在消耗甲醛分子,并降低交联的预期效率。  

5. 细胞裂解

       目标:破坏细胞和/或核膜,以分离出交联的蛋白质/DNA

       细胞裂解有助于细胞核的释放,并去除细胞质中可能造成背景信号的组分。您ChIP分析的成功将取决于裂解过程的效果和染色质的回收。一些ChIP操作指定使用含有高浓度SDS的裂解缓冲液,这裂解整个细胞,而其他一些操作指定使用细胞核分离的缓冲液。裂解是通过在适当浓度的去污剂缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物中孵育而实现的。我们也建议您通过机械力来裂解,使用dounce匀浆器、Mini-beadbeater匀浆器、涡旋振荡器或玻璃珠。您选择的方法将取决于您要处理的细胞或组织的类型。如果细胞裂解对您颇具挑战性,那么在裂解前后通过相差显微镜来观察样品可能会有帮助。这将让您能确定细胞核是否从细胞中释放,或是否使用全细胞裂解液,整个细胞或核膜是否已被破坏。 

6. 染色质断裂

       目标:将染色质打断成适合ChIP的长度(200 – 1000 bp)

       断裂以确保高分子量染色质的蛋白质/DNA复合物是可溶的,能被您的ChIP抗体接近。您所选择的断裂方法应取决于您是开展N-ChIP还是X-ChIP(详见3.1.2)。如果您开展N-ChIP,您应当用适当的酶(如微球菌核酸酶)将DNA片段化,因为机械剪切方法会破坏天然的组蛋白/DNA结合。如果您开展X-ChIP,您可以选择超声破碎或酶促消化,以使您的DNA片段化。在任一种情况下,必须优化剪切条件,且每次实验严格使用相同的条件,以减少起始染色质变化的可能性。

关键点

重复已发表的剪切方案而无需优化可能颇具挑战性。当您的仪器不同于那些方案中所使用的仪器时,尤其如此。目前有各种超声破碎仪器,水浴和基于探头的。在使用基于探头的超声破碎仪时,选择一个适用于您的样品体积的探头。在任何情况下,剪切参数都应当根据您的样品体积、细胞密度和细胞类型而优化;

优化应当包括功率设置(超声时间 vs. 间隙时间/休息时间)以及获得长度为200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数。这个大小很重要,因为下游分析通常只检测大小为100 – 200 bp的扩增子,包含一个感兴趣的结合位点。为了成功优化,每个优化实验只优化一种参数;例如,让功率设置保持不变,而改变循环数;

超声破碎的效率也因每种细胞类型以及细胞数量而不同。对于不同的细胞或组织类型,您需要开展单独的优化;

注意时间和功率设置。过度破碎和太高功率设置会损害您用在免疫沉淀步骤中的表位。这将降低您的ChIP信号;

始终保持裂解液冰冷,并间断超声,而不是连续,因为超声处理产生热量,会使染色质变性。在超声破碎过程中避免气泡。泡沫会导致蛋白质的表面变性,可能使染色质损失在气泡中。为了避免这种情况,一开始设为较低功率,再逐步提高;

在优化条件时,每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。为了获得好的大小,您应当开展额外的纯化步骤,以便在电泳前纯化DNA。剪切不足所产生的大的不溶蛋白质DNA:RNA复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔,并延缓电泳过程。通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。;

注意,异染色质可能耐受超声破碎,这可能会降低染色质的产量。 

7. 免疫沉淀

    目标:使用适当的抗体从染色质提取物中分离蛋白质靶点/DNA复合物

    抗体选择

       选择一个适当的ChIP抗体是ChIP实验迈向成功的关键步骤之一。即使是高质量的抗体,在Western blot验证中表现很好,也可能不适用于ChIP。只考虑那些专门为ChIP验证过的抗体。如果您的抗体未经过专门的质量控制和ChIP验证(如ChIPAb+™经过验证的抗体/引物套装),我们建议您评估几种可能的抗体,再选择一个用于您真正的ChIP实验。以下是您选择抗体时需要考虑的因素。

        单克隆或多克隆抗体都适用于ChIP。单克隆抗体识别蛋白质靶点上的特定表位。单克隆的优势在于高度特异,非特异结合的倾向较低。此外,单克隆抗体的每个批次更加一致,因为它们克隆性质的可变性低。不过,如果被单克隆抗体识别的表位被遮蔽或在之前的步骤中被改变,如交联,则单克隆抗体将无法分离出您的蛋白质靶点和与其结合的DNA序列。幸运的是,这种遮蔽很少影响单克隆抗体。

       与之相反,多克隆抗体识别蛋白质靶点的多个表位。因此,即使少数表位因交联而遮蔽,但多克隆抗体可能更有效。不过,因为多克隆识别多个表位,这就增加了非特异结合的可能性。此外,还必须考虑到多克隆群体的特异性可能在免疫过程中随时间而变化,除非在制备或纯化前将所有血清合并,再进行抗体纯化。一个相关的问题是,大多数商业化的多克隆抗体存在批间差异。变化的程度将取决于供应商的生产和质量控制措施。例如,多克隆抗体的量比较有限。如果对抗体的需求量高,往往需要从宿主动物的免疫开始,再次生产多克隆抗体。

       因此,这些抗体的特异性和亲和力就存在批间差异。较大的抗体制造商,如默克密理博,能够免疫多只动物,并筛选和合并那些表现出适当亲和力和特异性的材料,从而解决这个问题。为了确保一致性,抗体的性能可与之前的批次进行比较。无论您选择单克隆还是多克隆抗体,在选择ChIP的商业化制备抗体时,理想的抗体将带有证明特异性的数据,以及显示在ChIP及其他关键应用中性能可靠的数据。

关键点

无论您为ChIP实验选择单克隆还是多克隆抗体,您都必须根据您的特定分析来优化您抗体的稀释度。如果使用过量的抗体,您在蛋白质靶点的免疫沉淀中会获得成功,但你也会观察到过高的非特异结合或降低的特异信号。相反,如果您使用过少的抗体,您将观察到靶点的回收率低;

为了获得好的结果,ChIP抗体应经过充分鉴定,证明它能与蛋白质靶点结合,经过严格的特异性检测,经过ChIP的验证;

仅仅因为抗体在Western blot中表现不错,也不一定表明它在染色质免疫沉淀中表现佳。与Western blot检测变性的蛋白质不同,ChIP的抗体必须能识别天然状态下的蛋白质靶点。


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关键词:基因表达定量,基因表达调控,表观组学技术服务

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