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科研小白一文读懂ChIP-seq

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科研小白一文读懂ChIP-seq

发布日期:2018-09-29 作者: 点击:

什么是 ChIP-seq

ChIP-seq 是染色质免疫沉淀测序的简称。 基本上,ChIP-seq 是与 DNA 结合蛋白共沉淀的基因组 DNA 片段的测序。 以这种方式常研究的 DNA 结合蛋白是转录因子(例如 p53 或 NFκB),染色质修饰酶(例如 p300,组蛋白去乙酰化酶),与基因组 DNA 相互作用的组蛋白修饰(例如 H3K4me3)和转录复合物成分(例如 RNA polII)。 从技术上讲,这项技术可以无偏见地识别与特定 DNA 结合蛋白相关的基因组中的所有 DNA 片段。 我们说「无偏见」,因为免疫沉淀物中的所有 DNA 都会被测序,因此该技术不需要预先知道精确的 DNA 结合位点。

通过了解蛋白质的 DNA 结合位点,如转录因子,我们能了解什么?

相当多。转录因子的主要功能是识别并结合到基因组中的特定位点,招募辅因子,从而调节转录。 转录因子的第一个作用是发现并结合 DNA 片段,并且 ChIP-seq 允许在整个基因组范围上鉴定转录因子的结合位点。可以计算被结合蛋白识别的 DNA 序列 motif; 基因组中的任何转录因子的精确调控位点都可以被识别; 可以确定任何转录因子的直接下游目标; 并且可以预测特定 DNA 位点处转录调节蛋白群。

ChIP-seq 实验怎么做?

第一步取决于正在研究的蛋白质(图 1)。对于许多蛋白质-DNA 相互作用,特别是对于瞬时结合因子,第一步可能是使用甲醛作为交联剂来固定相互作用。然而,这对于定位组蛋白修饰或简单地核小体定位可能不是必需的,因为组蛋白-DNA 相互作用即使在没有交联剂的情况,一般也已足够强,在这种情况下,不需要交联的天然 ChIP(N-ChIP)可能是更合适的 [1]。在研究染色质重塑酶,例如组蛋白去乙酰化酶(HDACs)或组蛋白乙酰转移酶(HATs)时,可以在与甲醛交联之前,增加额外的交联步骤(使用双琥珀酰亚胺戊二酸酯)以保留蛋白质-蛋白质复合物 [ 2]。交联后,将染色质片段化成约 150-500bp 的片段。对于交联条件下的转录因子 ChIP,染色质片段化是使用超声处理完成的。获得足够的、可重复的片段非常重要,因为制备后续的测序文库需要片段大小为 200-300bp。对于 N-ChIP,用微球菌核酸酶消化 DNA 以提供稍微更好的分辨率,因为它能将使核小体切成小单位(大约 150bp)。

基因表达调控

片段化后,下一步就是使用目的蛋白的特异性抗体进行免疫共沉淀。 ChIP-seq 实验的成功与否主要取决于与研究蛋白特异性结合染色质的显著富集。 通常我们检测多种抗体,选择一处 DNA 始终都能显著富集的位点作为阳性结合位点,并与非特异性对照抗体如抗-IgG 免疫沉淀的 DNA 进行比较,确定阴性对照位点没有富集。

一旦富集可信,该材料就可以进行测序了。 如果材料的数量不是限制因素(例如,来自组织培养),用于文库制备的 DNA 量约为 10 至 15 ng。 如果测序平台需要掺入接头并涉及 PCR 扩增步骤,则这可能形成相当大的偏差 [3,4],建议尽可能降低循环次数。 一旦材料被扩增,选择长度为 200 至 300bp 的 DNA 片段并测序。在 PCR 之前和之后,都存在交叉污染的风险,但可以通过制备非常少量的并行文库并在纯化扩增文库时使用单独的凝胶,使风险小化。

当材料有限时,如原代细胞或组织样品,则需要使用较低起始量的 DNA 建库。 通常是以增大扩增倍数作为代价,这引入了扩增偏差。 然而,避免这种情况的一种方法可能是使用 Helicos 下一代单分子测序平台,该平台可以以 50pg 作起始材料生成测序文库而不需要扩增 [4]。

将短序列片段(称为 tags)通过与参照基因组进行比对进计算,并鉴定出富集区域,称为峰呼叫步骤。

怎么判断 ChIP-seq 是否成功?

如果有一个对照样品,一个失败的 ChIP-seq 应该是有很少的 peaks,并且在 ChIP 和对照样品中选择基因组位点的并行检查应该显示较差的富集。 但是,即使对两个相同的文库进行测序,也会有几个区域显示出显著的计数差异(作为 FDR 的一部分)。 测试将是对选定的 ChIP-seq peaks 的 Q-PCR 验证。 对于具有良好 motif 表征的一些转录因子,可以检查在显著的被称为 peaks 的部分中出现的 motif。


本文网址:http://www.igenebook.com/news/375.html

关键词:基因表达定量,表观组学技术服务,基因表达调控

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