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表观遗传系列之三种研究DNA甲基化测序技术介绍

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表观遗传系列之三种研究DNA甲基化测序技术介绍

发布日期:2018-12-19 作者: 点击:

在表观遗传中,DNA甲基化修饰具有非常重要的地位,并且甲基化修饰方式多种多样,其中常见、研究广泛的是胞嘧啶杂环5号位的甲基化修饰,又称作5-甲基胞嘧啶(5mC)。

DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达定量。异常的DNA甲基化会导致发育异常、肿瘤等疾病的发生。因此,DNA甲基化的研究对于深入理解基因表达、个体发育以及疾病的发生、发展机制都具有重要意义。

DNA甲基化的形成机制和检测方法

逆境胁迫应答、遗传与DNA甲基化调控

今天主要介绍三种常见研究DNA甲基化的高通量测序技术:全基因组甲基化测序(WGBS)、简化甲基化测序(RRBS)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-Seq)。三种技术在检测范围、检测精度及适用范围各不相同,且都有各自的优势,可结合具体研究情况进行选择。


WGBS

重亚硫酸盐(Bisulfite)处理能够将未甲基化修饰的C碱基转化为U,而甲基化修饰C碱基将保持不变,因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。

WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing,全基因组甲基化测序)将Bisulfite处理与高通量测序技术相结合,能够绘制全基因组高分辨率DNA甲基化图谱,可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联。

WGBS具有单个碱基分辨率,研究的是全基因组甲基化,测序费用相对来说比较高,在预算有限但刚好样本量或基因组较小的情况下可以考虑WGBS(当然,预算够够的时候,什么都不用考虑直接用)。

WGBS

图1 WGBS技术路线图


RRBS

RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing,简化甲基化测序)是利用限制性内切酶MspⅠ酶对基因组进行酶切,富集CpG片段,再进行Bisulfite测序,从而对富集片段的甲基化展开分析。

RRBS是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法,可以极大幅度地提高CpG区域的测序深度,还能通过酶切位点过滤部分降解片段对结果的影响。并且由于RRBS主要关注CpG富集区域的甲基化,能够避免过多的数据浪费,可以更有针对性地研究覆盖区域的甲基化状态,在大规模的临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

基因表达定量

图2 RRBS技术路线图


MeDIP-Seq

MeDIP-Seq (Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing,甲基化DNA免疫共沉淀测序)是一种基于富集方法研究DNA甲基化的测序技术,针对不同甲基化类型选择不同抗体。

目前主要是利用5mC抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,在高CpG密度、高DNA甲基化水平区域具有很好的抗体亲合性,然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

MeDIP-Seq的覆盖范围主要是高CpG密度、高DNA甲基化水平区域,和RRBS相似,适用于大样本量的甲基化研究。与WGBS和RRBS不同的是,MeDIP-Seq检测的甲基化图谱不能精确到单个碱基位点。

样本要求

样本类型:真核生物,具有参考基因组和较为完整的注释;

推荐起始量:新鲜动物组织干重≥1g,新鲜植物组织干重≥2g,新鲜培养细胞数量≥3x107个,全血≥2mL;

样品质量:DNA浓度≥50 ng/μl,总量≥5μg,无 RNA污染,条带清晰,无降解。

另附上DNA甲基化分别在人、动物和植物中的应用案例解析。

应用案例一  DNMT3甲基转移酶在小鼠胚胎发育过程中的研究[1]

在胚胎发育早期,精子和卵子间,存在差异甲基化区域;差异甲基化的区域,囊胚期会被调整到低甲基化状态;在母源遗传的部分,还依然会保持一定的部分甲基化状态。通过研究小鼠在胚胎发育早期3.5~8.5d至成年甲基化变化过程,讨论DNMT3A和DNMT3B在de novo甲基化中的作用。

研究发现,小鼠胚胎发育过程中,4.5d~5.5d甲基化速率快,后期变化很缓慢; GpG岛的甲基化进展要慢于基因组其他区域,8.5d启动子区和外显子区甲基化率大于50%的基因分别与配子功能和发育过程相关的重要基因(参与转录因子的调控、胚胎形态发生)有关。

在早期外胚层,全局甲基化水平与DNMT3A/B的上调正相关;DNMT3A/B的作用是相似的,但DNMT3B在常染色和X染色体的CpG岛的甲基化起到主导作用。DNMT3B建立了印记位点,这些标记区分了生殖细胞和体细胞的甲基化印记。


应用案例二  Ph+慢性髓系白血病发展过程中DNA甲基化变化[2]

甲基化在许多恶性疾病的发病机理中有重要的生物学意义。慢性粒细胞白血病(CML)是一种源自干细胞的恶性肿瘤,可分为慢性期(CP),加速期(AP)和急变期(BC)。表观遗传变化,特别DNA甲基化在CML发展中的功能至今尚未详细研究。研究利用RRBS分析CP、AP和BC CML患者及对照个体的CpG位点甲基化差异,并利用RNA-seq研究这些样品中的基因表达情况。

RRBS研究结果显示,与对照组相比,CML甲基化CpG位点更多;CP-CML组仅鉴定了约600个差异甲基化CpG位点,BC-CML组则发现约6500个差异甲基化CpG位点。大多数受影响的CpG位点,甲基化水平增加。发展到AP-CML/ BC-CML的CP-CML组中,鉴定了897个在发展时甲基化,但在诊断时未甲基化的基因。

RNA-seq结果显示,与CP-CML组相比,BC-CML组中这些基因很多出现表达下调,其中一些是已知的肿瘤抑制基因或细胞增殖调节因子,而使用表观遗传药物可以使基因重新表达。

MeDIP-Seq

图3  AML患者与对照差异甲基化CpG位点分析


应用案例三 柳枝稷甲基化调控研究[3]

柳枝稷可用于提炼乙醇,在绿色生物燃料领域有重要价值。本研究进行BS、链特异性文库测序和小RNA文库测序,对柳枝稷DNA甲基化及其与编码、非编码RNA的调控关系进行了全面分析,为生物燃料作物的表观遗传研究提供了参考。

BS获得的 1,480,569个DMRs(Differential methylation regions),其中大部分CG型和CHG型的DMRs在叶中高甲基化,而几乎所有的CHH型DMRs在叶中低甲基化。

对每种甲基化类型分别进行甲基化水平与表达量比较和spearman相关性分析(图1),发现CG和CHG型启动子区的甲基化与基因表达负相关,CG型gene body区的甲基化与基因表达正相关,而CHG和CHH型呈负相关。

WGBS

图4 CG型甲基化与基因表达比较(左)和spearman相关性(右)



参考文献

[1]Auclair G, Guibert S, Bender A, etal. Ontogeny of CpG island methylation and specificity of DNMT3methyltransferases during embryonic development in the mouse[J]. Genomebiology, 2014, 15(12): 545.

[2]Heller G, Topakian T, Altenberger C,et al. Next-generation sequencing identifies major DNA methylation changesduring progression of Ph+ chronic myeloid leukemia[J]. Leukemia, 2016,30(9):1861-1868.

[3]Yan H, Bombarely A, Xu B, et al. siRNAsregulate DNA methylation and interfere with gene and lncRNA expression in theheterozygous polyploid switchgrass[J]. Biotechnology for Biofuels, 2018, 11(1):208.


本文网址:http://www.igenebook.com/news/413.html

关键词:基因表达定量,基因表达定量,MeDIP-Seq

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