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RNA修饰的口述历史|表观转录组分析技术发展

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RNA修饰的口述历史|表观转录组分析技术发展

发布日期:2018-12-21 作者: 点击:

近年来,越来越多的mRNA修饰被发现,并且可以参与多种调控过程,这些突破性的研究进展促使了一个新兴领域——表观转录组学 (Epitranscriptomics,又称“RNA表观遗传学”)的诞生。在表观转录组学领域的研究中,表观转录组技术的发展起着至关重要的作用,它不仅为探索mRNA修饰的功能提供了重要工具,也为该领域提供了崭新的研究方向。本文将对高通量表观转录组测序技术进行简述,由于篇幅所限,许多精彩的工作不能一一列举,若有遗漏,敬请谅解。

转录组测序


1、m1A的高通量检测方法

m1A是adenosine上的另外一种甲基化修饰,与m6A相比,m1A的甲基修饰位于Watson-Crick侧会影响正常的碱基互补配对,因此在反转录过程中m1A会阻滞反转录酶的延伸。2016年初,芝加哥大学何川教授研究组与以色列Gidi Rechavi课题组合作,实现了全转录组水平m1A的定位(Dominissini et al., 2016);我们课题组也同时开发了检测m1A的m1A-ID-Seq技术(Li et al., 2016)。这两种方法都利用了能够特异识别m1A的抗体来富集含有m1A的RNA,发现mRNA上的m1A显著富集在5’-UTR(Dominissini et al., 2016; Li et al., 2016)。

 

2、m6A的高通量检测方法

早在二十世纪七十年代,m6A已被证实存在于mRNA上,然而相关的研究进展并没有受到特别高的关注。2011年,芝加哥大学何川教授课题组首次发现m6A是一个“可逆”的动态修饰,开启了表观转录组学研究的全新领域(Jia et al., 2011)。该论文的第一作者贾桂芳博士,目前也已在北京大学化学学院开展工作。在这之后,两个研究组分别于2012年独立开发了高通量m6A检测技术(m6A/MeRIP-seq),第一次获得了转录组水平的m6A甲基化谱图(Dominissini et al., 2012; Meyer et al., 2012)。在该技术中研究人员使用能够特异识别m6A的抗体对含有m6A的RNA片段进行富集并进行高通量测序,蕞后通过生物信息学分析确定分辨率大约为100-200 nt的m6A富集峰(m6A peak)。利用该技术研究人员获得了小鼠和人的转录组的m6A甲基化谱图,并且进一步发现m6A主要富集在stop codon和3’-UTR区域 (Dominissini et al., 2012; Meyer et al., 2012)。在2015年,研究人员对m6A/MeRIP-seq的方法进行了进一步改进,通过利用紫外线诱导RNA与抗体交联的策略,获得了转录组水平上单碱基分辨率的m6A甲基化谱图(Chen et al., 2015; Ke et al., 2015; Linder et al., 2015)。除了m6A修饰位点信息以外,修饰比例也是研究人员所关心的问题。在2016年,研究人员通过对m6A免疫共沉淀过程中的上清样品及富集样品中的同一个转录本的表达量(利用ERCC内参进行校正)进行比较,开发出一种名为m6A-LAIC-seq的技术实现了在全转录组水平上对m6A 修饰比例的测定 (Molinie et al., 2016)。

 

3、m5C的高通量检测方法

亚硫酸氢盐(bisulfite)测序已经被广泛用在DNA上的m5dC修饰位点检测中,但是由于bisulfite处理会导致RNA的降解,因此并不能直接用于RNA中的m5C检测。在对bisulfite处理方法进行优化之后,2012年研究人员第一次获得全转录组水平的m5C谱图(Squires et al., 2012);而近年来,基于亚硫酸氢盐的测序技术已经被用于多个物种转录组中的m5C谱图的鉴定(Amort et al., 2017; David et al., 2017; Edelheit et al., 2013)。北京基因组研究所的杨运桂研究员通过对该测序方法进一步优化,在对mRNA上的m5C研究中取得了重大的突破,相信不久后大家就可以看到他们精彩的工作。除了亚硫酸氢盐测序技术外,在2013年两个研究组还利用m5C甲基转移酶的特点分别独立开发了Aza-IP与miCLIP技术,实现了对于m5C甲基转移酶——NSUN2与DNMT2修饰底物的鉴定(Hussain et al., 2013; Khoddami and Cairns, 2013)。

 

4、Inosine的测序方法

Adenosine-to-inosine (A-to-I) editing是高等真核生物的RNA上一种常见的RNA编辑形式,并且主要发生在双链RNA区域(dsRNA) 例如UTR与intron区域的Alu元件上。由于在反转录过程中,I会与C配对,因此在蕞终的测序中会产生A-to-G 错配信号。目前大部分的Inosine的高通量测序检测技术都是基于此原理,通过比对转录组与基因组测序结果确定发生A-to-I editing位点。由于这种高通量检测方法会受到SNP及测序错误等因素的影响,因此为了尽量减少假阳性的产生,合适的生物信息学分析手段在这里发挥了重要作用(Kleinman and Majewski, 2012; Li et al., 2011; Lin et al., 2012; Pickrell et al., 2012);例如,斯坦福大学的Jin Billy Li教授就发展了多种方法来提高检测灵敏度与准确性(Li et al., 2009; Ramaswami et al., 2012; Ramaswami et al., 2013)。此外,中科院-马普学会计算生物学研究所杨力研究员与上海生化与细胞所陈玲玲研究员也在该领域做出了突出贡献。除了检测A-to-G 错配信号之外,研究人员还利用了Inosine可以特异性地与化合物acrylonitrile反应并且加成产物ce1I会阻滞反转录酶延伸的特性,发展名为ICE-seq的测序技术也实现了转录组水平Inosine的鉴定(Sakurai et al., 2014)。

 

5、Ψ的高通量检测方法

Ψ是U的异构体,与U相比,Ψ并没有改变碱基互补配对,在反转录过程中Ψ仍与A配对,因此不能直接通过测序将Ψ与U区分开来。在2014年,研究人员利用Ψ可以特异地与化合物CMCT反应并且阻滞反转录酶延伸的特性,将其与高通量测序相结合,发展了名为Ψ-Seq, Pseudo-seq and PSI-seq的测序方法(Carlile et al., 2014; Lovejoy et al., 2014; Schwartz et al., 2014),实现了全转录组水平上单碱基分辨率的Ψ定位。早在2012年我们研究组也开始开展了对于Ψ高通量测序技术(CeU-Seq)的开发:我们采取了不同的策略,首先对化合物CMCT进行改造,设计并合成了具有叠氮基团的CMCT衍生物——N3-CMCT,该化合物不仅可以特异地与Ψ反应同时也可以通过点击化学反应(click reaction)将biotin与被标记的含有Ψ的RNA偶联,因此可以在测序之前对含有Ψ的RNA进行富集,从而显著提高了Ψ检测的灵敏度(Li et al., 2015)。

 

展望

随着技术的发展,mRNA上越来越多的修饰被发现。与组蛋白上的多种修饰具有不同的调控功能类似,mRNA上修饰也有可能具有不同的功能;而对于这些修饰是否可以形成调控网络、在空间上是否具有一定的关联目前都是未知数。随着三代单分子测序技术等新技术的发展,也许在不久的将来同一转录本上的多种修饰的同时检测可以实现,从而为表观转录组学的研究提供了新的可能性。

 

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关键词:MeRIP-seq,转录组测序,表观转录组学

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