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NanoString数字基因定量技术原理

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NanoString数字基因定量技术原理

发布日期:2019-01-03 作者: 点击:


NanoString数字化基因分析系统是蕞新的多重基因定量检测技术。此技术可直接检测条形码探针标记的单个mRNA转录子,并通过数字计数进行定量;它仅需100 ng的RNA即可对逾八百个特异的mRNA转录子进行准确的定量;它无需酶促和扩增过程,其检测的敏感性和准确性与实时荧光定量PCR(RQ—PCR)技术相当。近年来,NanoStfing技术的特点及优势使其被越来越广泛地应用到生物医学前沿领域,包括高通量基因表达结果验证、基因表达谱研究、基因调控网络研究、临床疾病分子分型及诊断预后等领域。

 

随着后基因组学和系统生物学的发展,在特定生物学过程或疾病状态中对转录水平RNA表达的高通量研究越来越受到关注,并成为人们深入了解生物学过程中转录调控、信号转导机制、疾病分子病理分型等的重要工具。

基因芯片、RNA测序等技术应用于高通量基因表达谱研究,产生了大量基于各种生物过程及疾病模型的信息;但由于其检测敏感性和准确性不足,往往需要对结果中大量的信息进行进一步的筛选和验证。传统的实时荧光定量PCR(real—time quantitative PCR,RQ.PCR)方法敏感性高,准确性好,是高通量研究最常用的验证方法;

但其通量不足,在需要对多个基因定量的情况下,实验设计及操作步骤繁琐。NanoString数字化基因检测技术(NanoString nCounter Analysis)是新一代的多重核酸定量技术,在基因表达谱的验证、研究和临床应用中扮演了越来越重要的角色。

 

NanoString技术在一个体系中可进行逾八百个的颜色条码探针和特异性序列的杂交反应,蕞后直接以数字化输出的形式读取定量结果。此技术自动化程度高,反应中无需酶逆转及扩增的过程,避免了相关偏差,其检测敏感性、准确性和实时荧光定量PCR技术相当。

 

2008年《NatureBioteehnology》杂以封面文章形式报道了NanoString技术,至今PubMed数据库已有逾百篇应用这一方法开展研究的文章,其中多篇文章发表在《Nature》、《Cell》等一流杂志上。本文将这一技术的原理及应用作一简述。

 

 

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 NanoString技术原理

 

NanoString技术是基于核酸分子与探针杂交后,对探针上的颜色分子条形码标记直接探测、计数而实现多重定量的检测技术。其核心技术原理包括分子条形码技术和单分子成像数字计数技术。NanoString可检测各种类型的核酸,以下以mRNA定量检测为例介绍其原理。

 

1.1 基本原理

NanoString分子条形码技术在NanoString杂交反应体系中,针对每一个目标mRNA分子会设计一对分子探针,每对探针包括一个在5’端载有颜色条形码color barcode)标记的约35~50 bp的报告探针和一个在3’端载有生物素的约35~50 bp捕获探针(图l)。报告探针5’标记的颜色条形码共有6个位置,每个位置可以是4种颜色的荧光团中的一种。

 

探针的颜色条码标记使得每一种条码对应每一特异的目标mRNA序列。条码中6个序列位置的4种颜色排列组合理论上允许有4^6(即4096)种方式,但需要排除易混淆的相近颜色条形码的探针和内置阳性对照、阴性对照所需的探针,在一个标本中可同时检测约八百个不同的条码即约八百种不同的目标mRNA序列。

 

 

 

1.2  NanoString单分子成像技术

单分子成像是指对反应体系中各个特异mRNA目标分子进行直接的绝对数字计数。样品探针混合物杂交完成后,经过纯化洗脱、杂交产物固定于样品板、电极极化等步骤,使所有杂交信号以同一方向位于同一成像平面上,进而可由数字成像分析系统对样本板上的报告荧光信号进行扫描、处理图片信息及数字计数。

 

图片信息处理中,每一个特异颜色条形码标记的探针信号将对应一个特异的mRNA序列,即这一特异mRNA分子的一次计数,最终将产生一个对应于反应体系中多个颜色条码即多个特异目标mRNA分子计数信息的计数文件(图2),从而实现了对多种特异mRNA序列的绝对计数。

 

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NanoString技术特点

 

2.1 可重复性好、准确性和敏感性高

NanoString技术是基于杂交后对报告探针上的荧光基团条形码标记的直接检测,其无酶促反应或PCR扩增等步骤,不会因检测样品质量不佳造成对酶活性的影响,也无扩增引人的误差产生;同时,这一检测技术自动化程度高,主要依赖于样本制备站和数据分析站的自动化操作,手动操作简单,可避免更多的人为误差。实验证明,NanoString在样本核酸3个log动态范围内多次平行重复的平均R2为0.999。

 

NanoString技术检测敏感性高、线性范围广。在一个100 ng总RNA和500个基因探针的反应体系中,中,NanoString技术最低检测限为0.1~0.5 fmol/L。以每个细胞含10 Pg RNA来计算,即蕞低可检测到每个细胞中0.2~1个拷贝数,且这一检测在浓度大于2.5个log的范围内检测计数值和浓度均有很好的线性关系(线性回归系数>0.998)。

 

2.2 多种类型核酸的检测

NanoString技术在原则上可用于检测任何类型的核酸样品。除了mRNA,它还可以对非编码RNA包括微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)以及DNA等各种类型的核酸进行多重定量。NanoString可广泛地应用在mRNA、miRNA、lncRNA基因定量表达谱、基因组DNA拷贝数变异性(CNV)以及DNA、RNA病原体的检测。

 

2.3 标本来源的多样化

NanoString技术是基于直接检测杂交后报告探针上的荧光基团标记,进行计数分类,无需PCR扩增或其他酶促反应,即无扩增误差,能检测出样品中低丰度的mRNA,即使样品质量不佳也能进行杂交、扫描,因此NanoString技术可检测多种来源的标本。

 

它除了可对多种来源组织细胞提纯的核酸进行定量,还可对新鲜或冻存组织、细胞、细菌等的裂解物以及多聚甲醛固定石蜡包埋(formalin—fixed paraffin embedded,FFPE)组织细胞的裂解物等直接进行定量检测。

 

2.4 标本量要求少、通量较高、操作简单

NanoString技术仅需少量的RNA(100 ng)就能完成对逾八百个特异转录子序列的准确定量。NanoString检测系统自动化程度高,由样本制备仪和数字化分析仪2部分组成,对12个样本的检测可同时上机进行,整个手动操作过程为15~30 min。

 

下面我们主要介绍一下nanostring技术在肿瘤分子分型诊断与预后领域的应用

 

NanoString表达谱用于疾病的诊断和预后

肿瘤的诊断和预后一直以来主要是依据患者的年龄、肿瘤的大小、是否存在转移等临床及组织细胞病理辅助检查特征来判断的。基因表达谱能从分子水平更准确地表现患病组织的疾病状态,从而可为患者提供更具体的个体化疾病分子诊断及预后分层的新方案。

 

目前,基因表达谱分子分型研究已广泛地用于乳腺癌、髓母细胞瘤、淋巴瘤等多种肿瘤,其中乳腺癌的表达谱分子分型已应用于临床。乳腺癌分子分型表达谱PAM50是一个基于NanoString技术的分子病理分型检测。这一表达谱可将乳腺癌依其内在分子表达特征分为管腔A型(1uminal A)、管腔B型(1uminal B)、Her2富集(Her2一Enriched)及基底样(Basal-1ike)型,每一型都有其独立的预后特征。

 

PAM50对淋巴结阴性且尚未接受辅助治疗患者的无复发生存率进行预测,与标准的病理学参数比较,证明可以更准确地预测乳腺癌患者的10年无复发生存率。目前,基于NanoString技术的这一检测方法已通过欧盟的认证并已用于临床。

 

髓母细胞瘤通过组织学分子分型可将其分为4类核心亚组,即WNT、SHH、C组和D组。每个亚组具有特异的人口统计学特征和转录组、基因组表型以及临床表现和预后。过去,这类分型需要从急冻标本获取高质量的RNA并通过基因芯片高通量检测来实现;

 

而使用NanoString技术,通过对髓母细胞瘤分子分型中关键的25个基因的mRNA表达进行高灵敏度和准确性的检测即可进行分子分型,其结果和基因芯片结果相关性好,在130例的验证组实验中,一致率高达98%。

 

Scott等将进展期非霍奇金氏淋巴瘤用NanoString检测的23个基因表达谱进行风险预测,此方法的预测相比国际预后积分(IPs)和CD68免疫组化检测其对疾病预后能力更佳。

 

Lira等应用NanoString技术对肺非小细胞癌标本多种断裂点的ALK融合基因进行检测,此方法的敏感性高,与FISH及免疫组化方法结果高度一致;并可确定各种断裂点亚型的融合基因及其表达水平,可用于肺非小细胞癌的分子诊断。

 

基因表达定量


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关键词:基因定量表达,基因表达调控,表观组学技术

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